白花丹素对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果

刘碧涵，王 峰，张陆成，袁建辉，*

1.广西医科大学生命科学研究院，广西 南宁 530021；2.广西医科大学基础医学院生理学教研室，广西 南宁 530021

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，MSSA）是一种常见的革兰阳性致病菌，其可感染人体的胃肠道、皮肤和鼻腔等部位，引发皮肤感染和心内膜炎等疾病[1]。随着抗生素的广泛使用，一些MSSA 对常用的甲氧西林类药物产生了耐药性，这类细菌被称为“耐甲氧西林金黄色葡萄球”（Methicili-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）[2]，该菌也是引起体内感染的重要病原菌之一。相较于MSSA，MRSA 能够分泌多种毒力因子，更难被普通药物杀灭，会严重危及患者的生命安全[3]。白花丹素（plumbagin）是从传统中草药白花丹中提取的一种羟基萘醌类化合物[4]，其在抗癌、抗菌、抗炎等方面表现出了很强的生物活性[5]。近期的研究发现，白花丹素对多种细菌都具有抑制作用，对细菌的生长、聚集、代谢等都产生了影响。本文基于此研究白花丹素对MRSA 和MSSA 的抑菌效果，有助于发现新的抗菌作用靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

实验材料：金黄色葡萄球菌（ATCC 25293，MSSA）与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ATCC 43300，MRSA），菌株由广西医科大学微生物教研室赠予，保存在-80 ℃的冰箱中，复苏使用；TSB 培养基，TSA 琼脂培养基，0.1%结晶紫水溶液（北京Solarbio）。

实验仪器：恒温培养摇床（上海一恒THZ100），超纯水机（YYTIII-20L），超低温冰箱（海尔DW-86L578J），培养箱（ZXDP-A2160），医用冷藏冰冻冰箱（海尔HYCD-282），生物安全柜（海尔HR40-IIA2），TriStar2 LB942 多功能酶标仪（德国Berthold）。

1.2 实验方法

1.2.1 测定白花丹素对MSSA 和MRSA 的MIC

将MSSA 和MRSA 复苏后，在TSB 培养基中传代三次；在96 孔板中对白花丹素进行梯度稀释，使药物质量浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、0 μg/mL，加入对应的细菌悬液，使细菌浓度达到1×105CFU/mL，以无菌TSB 肉汤为阴性对照；37 ℃恒温震荡摇床过夜培养，次日观察孔内的浑浊程度，肉眼澄清即为最低抑菌浓度（Minimal Inhibit Concentration，MIC）。重复三次实验。

1.2.2 测定白花丹素对MSSA 和MRSA 的MBC

在进行1.2.1 的实验后，选择96 孔板中未产生浑浊的澄清孔，每孔取10 μL 涂布在TSA 平板上，于37 ℃恒温培养箱中静置培养24 h。平板上无细菌生长即为最小杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）。重复三次实验。

1.2.3 建立MRSA 和MSSA 的生物被膜体外模型

MRSA 和MSSA 分别传代三次后，用培养基将菌液稀释，调整OD600为0.5；在96 孔板中每孔加入200 μLTSB 和2 μL 菌液，尽量避免出现挂壁现象；于37 ℃的恒温培养箱中静置培养24 h；培养结束后，弃去TSB 培养基，用无菌PBS 溶液缓慢清洗，得到金葡菌成熟的生物膜体外模型。

1.2.4 使用结晶紫染液测量白花丹素对成熟生物膜的清除情况

得到生物膜体外模型后，弃去旧TSB 培养基，在孔板中分别加入预先用TSB 培养基稀释好的白花丹素（512、256、128、64、32、16、8、4、0 μg/mL），每孔加入200 μL，每个浓度重复三组。药物作用24 h后，吸弃培养基，加入无菌水轻柔润洗一遍；加入200 μL 0.1%的结晶紫水溶液，室温染色20 min，弃去染液，再用无菌水轻轻润洗两遍，置于烘箱中15 min 烘干，用30%的乙酸将其溶解，使用多功能酶标仪测量OD575。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.4.2 作图，S 用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MIC 测定结果

实验结果表明，白花丹素对MSSA 和MRSA 均有明显的抑制作用，对MSSA 和MRSA 的MIC 分别为16 μg/mL 和8 μg/mL（见表1）。这表明在菌液中悬浮培养时，白花丹素对MRSA 的清除效果更佳。

表1 白花丹素对MSSA 和MRSA 的MIC、MBC

2.2 MBC 测定结果

实验结果表明，白花丹素对MSSA 和MRSA 都具有明显的杀伤作用，对MSSA 和MRSA 的MBC 均为32 μg/mL（见表1）。

2.3 白花丹素对MSSA 成熟生物膜的清除作用

当未使用白花丹素对其进行处理时，MSSA 菌群生长状况良好，24 h 后生物膜的形成到达稳定期。在加入4 μg/mL 白花丹素的条件下，MSSA 菌群的生长开始受到抑制，OD575值下降至1.0 左右，且对浓度存在依赖性，浓度越高抑制作用越强；当白花丹素的质量浓度增长到128 μg/mL 时，菌群的生长能力下降更加明显，OD575值可下降至0.5 左右；差值具有统计学意义（如图1 所示，***P<0.001）。

图1 白花丹素对MSSA 成熟生物膜的清除能力

2.4 白花丹素对MRSA 成熟生物膜的清除作用

未使用白花丹素进行处理时，MRSA 菌群的生长状况良好，24 h 后生物膜的形成量趋于稳定。当加入的白花丹素的质量浓度达到32 μg/mL 时，MRSA 菌群的生长开始受到抑制，OD575值下降至0.7 左右，且对浓度存在依赖性，随着白花丹素浓度升高，抑制作用逐渐增强；当白花丹素的浓度增长到512 μg/mL 时，OD575值可下降至0.5 左右，差值具有统计学意义（见图2，**P<0.01、***P<0.001）。

图2 白花丹素对MRSA 成熟生物膜的清除能力

3 讨论

MSSA 是常见的食源性致病菌，其可引发食物中毒，给机体健康造成危害；还可以黏附到可植入的医疗设备上，引起生物膜感染。近年来，药物滥用导致MRSA 大量产生，MRSA 与普通的金葡菌相比具有更强的生物膜形成能力。由细菌群落组成的复杂无底多细胞联合体被称为“生物膜”[6]，细菌在生物膜状态下对抗菌剂的敏感性会降低，生长和代谢速度也会减缓，这导致金葡菌的治疗更加困难，寻找可替代药物进行治疗迫在眉睫。

本实验研究了白花丹素对MSSA 和MRSA 的体外抑菌效果，确定其在溶液中对两种金葡菌均有显著的抑制效果，对MRSA 的抑制效果尤其优秀，MIC 仅为8 μg/mL。在应对生物被膜状态时，白花丹素也发挥了明显的清除作用，但相较于MSSA，MRSA 的生物膜显然更难被清除，这与其耐药特性和独特的群落感应系统有关，也是我们在后续实验中需要多加关注的焦点；可以与其他药物联合使用，让白花丹素更有效地作用于MRSA 的生物膜系统，从而全方位地对MSSA 造成杀伤。对白花丹素的抗菌效果进行深入研究，不仅有助于寻找抗生素的替代疗法，而且能为研发新型抗菌药物开辟新途径。