用于次氯酸根离子检测的新型荧光探针

赵 飘，唐梦珂，昝永强

1.临沂大学化学化工学院，山东 临沂 276000；2.临沂大学医学院，山东 临沂 276000；3.临沂市妇女儿童医院（大学院区），山东 临沂 276000

次氯酸钠（NaClO）作为一种弱酸，不仅经常应用于实际生产生活中，也广泛存在于生物体的细胞内。

目前以荧光探针为基础的荧光成像技术凭借其强大的时间、空间分辨能力和高灵敏度而广受关注，近年来，Zhang 等[1]开发了一种可以在生理条件下检测次氯酸的新型荧光探针，其响应速度快（t1/2<30 s）且荧光增强倍数大（>1 000 倍），具有很高的灵敏度和选择性。Afzal 等[2]以Rhodol 分子为骨架，螺环肼基为次氯酸反应位点，设计合成了一种新型荧光探针。并在探针中引入两个羟乙基以提高探针的亲水性能，从而实现了在纯水中对次氯酸快速的特异性检测。尽管至今已经有了较多有关次氯酸检测的文献报道，但当前的探针仍存在一定的缺陷，比如选择性差、响应速度慢等，所以本文以对氨基苯酚为反应基团，以具有强荧光发射的Rhodol 染料为荧光团，设计合成了对次氯酸具有高选择性的荧光探针。

1 实验试剂与仪器

试剂：DMF、NaClO、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、NaF、NaCl、（NH4）2SO4、Mn（ClO4）2·6H2O、TBHP、MgCl2·6H2O、H2O2、ZnCl2、NaNO3、NaNO2、Cu（NO3）2·3H2O、FeCl2·4H2O。

仪器：NilkonCesi 激光共聚焦显微镜（日本）。

2 荧光探针Rh-p-Ap 的合成

合成中间体1∶1.01 g 间苯二酚、1.40 g 对氯硝基苯和1.68 g 干燥K2CO3，溶于20 mL DMF 中，使用N2保护，反应温度为100 ℃，反应12 h。用二氯甲烷和水进行萃取，收集有机相，过柱子，淋洗剂为PE/DCM =1/0-1/1。得到1.77 g 浅黄色中间体1，产率为89%。

合成中间体2：将2.12 g 的2-（4-N，N-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸和1.49 g 中间体1 溶于15 mLTFA 中，反应温度为85 ℃，反应12 h。反应完成后，加水稀释，将溶液的pH 调至中性。使用DCM 和水进行萃取，收集有机相，过柱子，淋洗剂为DCM/EA = 10/1-3/1。得到1.93 g 粉红色中间体2，产率为62%。

合成中间体3：将1.55 g 中间体2 溶于20 mL干燥的EtOH 中，在搅拌、冰浴的条件下缓慢加入2 mLH2SO4，使用N2保护，在85 ℃的条件下反应12 h。反应完成后，加水稀释，再加入3 g 的NaCl，搅拌30 min，后将溶液的pH 调至中性。使用DCM 和水进行萃取，收集有机相，过柱子，洗脱剂为DCM/EtOH= 20/1-5/1。得到1.57 g 红色中间体3，产率为90%。

合成探针Rh-p-Ap：将中间体3 和3.94 g 的SnCl2·2H2O 溶于20 mL 干燥的EtOH 中，加入0.2 mL 浓盐酸，使用N2保护，85 ℃条件下反应10 h。反应完成后冷却至室温，将反应物倒入水中，再加水将溶液的pH 调至中性，过滤，固体部分用10 mLDCM洗3 次，收集滤液，滤液用20 mLDCM 萃取3 次，合并有机相，干燥后旋干，过柱子，洗脱剂为DCM/EtOH = 20/1-5/1。得到0.72 g 红色探针Rh-p-Ap，产率为61%。

3 结果与讨论

3.1 Rh-p-Ap 识别性能的研究

首先，本研究测试了探针对不同浓度ClO-的响应。如图1a）所示，向含探针的PBS/EtOH=4/1（pH =7.4，10 mM）溶液中加入不断增多量的ClO-，溶液的荧光强度也逐渐增加，当加入8 倍浓度的ClO-时，探针荧光强度达到了最高峰。表明随着ClO-浓度的增大，更多的探针被氧化生成了相应量的Rhodol 染料。这是因为探针存在氨基苯基结构向Rhodol 部分的PET 过程，如图1b）所示，导致探针的荧光被淬灭，探针本身没有荧光；与次氯酸钠反应后，探针氨基苯基结构被氧化成对氨基苯醌结构，从荧光团上脱落下来，生成具有强荧光发射的Rhodol 染料，因此探针的荧光强度随着次氯酸钠浓度的增大而逐渐增强。本研究使用三倍标准偏差法CDL=3σ/k 测得探针Rh-p-Ap 对ClO-的检测限为57.63 nM，如图1c）所示。

图1 Rh-p-Ap 与NaClO 反应的a）荧光光谱、b）反应机理图及c）检测限测定图

下一步，我们研究了探针ClO-的选择性及其抗干扰性。如图1a）所示，向探针溶液中加入各种干扰离子后，探针Rh-p-Ap 的荧光强度几乎没有变化，只有加入次氯酸后探针荧光强度才有了非常明显的增强，表明探针对次氯酸具有非常高的选择性。而向含有探针的溶液中加入其他干扰离子后再加入ClO-，结果如图2b）所示，探针与ClO-和其他离子共存反应的荧光强度与探针单独加ClO-的荧光光谱几乎一致，表明在有其他干扰离子的情况下，探针仍然可以检测到ClO-，具有很强的抗干扰性。

图2 探针检测次氯酸钠的a）选择性和b）抗干扰性图

3.2 探针Rh-p-Ap 的细胞成像研究

为了进一步探针在生物方面的应用价值，本研究首先用cck-8 法测试了探针Rh-p-Ap 对细胞活性的影响，如图3 所示，可见探针浓度在10 μM 以内细胞中的存活率大约在80%以上，证明Rh-p-Ap探针对细胞的毒性不大。

图3 A）不同浓度探针与海拉细胞共孵育12 h 后细胞活性图；B）a）探针明场图；d）探针荧光图；b）探针加ClO-明场图和e）成像图；LPS、PMA 孵育后加探针c）明场图和f）成像图

接下来，利用荧光显微镜成像技术测试探针Rh-p-Ap 在Hela 细胞中对内源和外源次氯酸根的识别效果。如图3（d）所示，加入探针的Hela 细胞没有荧光，加入ClO-溶液后，在细胞中能够观察到荧光明显增强，如图3（e）所示，证明探针能够用于外源性ClO-的细胞成像。在用脂多糖和佛波醇酯刺激产生活性氧的细胞中加入探针，如图3（f）所示，成像观察到了很强的荧光发射，证明Rh-p-Ap 能对细胞内源性ClO-有响应。

4 结语

综上所述，本文设计并合成的新型荧光探针Rh-p-Ap，以Rhodol 分子为骨架，以对氨基苯醌为识别基团，可以选择性地响应次氯酸根离子。Rh-p-Ap 探针在PBS/乙醇=4/1（pH = 7.4，10 mM）溶液中能够对HClO 迅速反应，且荧光光谱显示荧光明显增强。检测限为57.63 nM，此外，探针对海拉（Hela）细胞的毒性较低，能实现细胞的外源性和内源性HClO 成像。因此，探针有望成为生物条件下检测次氯酸根离子的重要手段。