毛细管电泳法分析IgG4 型生物类似药纯度

段 颖，谭澄莹，李国柱，秦国宏

南京正大天晴制药有限公司，南京 210046

生物类似药因具有疗效好、性价比高等优势，近年来在国内外医药企业中掀起了研发热潮[1]。但其本身结构复杂，存在多样性修饰。生产过程的复杂性和研发企业对原研了解的局限性，决定了类似药研发的难度较大[2]。

类似药的质量分析对检验方法提出了极大的挑战[3]。纯度作为抗体的关键质量属性[4]，也是质量分析的重点[5-6]。十二烷基硫酸钠毛细管电泳（capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，CE-SDS）凭借其高灵敏度和高分辨率为抗体的纯度分析提供了高质量数据[7-8]。

本研究以IgG4 型生物类似药为例，建立了毛细管电泳法，解决了体积排阻色谱法（size exclusion high performance liquid chromatography，SE-HPLC）进行纯度分析的局限性。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

Acquity Arc 高效液相色谱仪（Waters 公司）；XSR204 电子天平（精度：0.1 mg；Mettler Toledo 公司）；Maurice 毛细管电泳仪（ProteinSimple 公司）；MK-10 干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司）；5910R 离心机（Eppendorf 公司）；IQ7000 纯水仪（Milli-Q 公司）。

1.2 试药

十二水合磷酸氢二钠（批号20201106，国药）；二水合磷酸二氢钠（批号20201113，国药）；氯化钠（批号20201216，国药）；TSKgel G3000 SWXL 色谱柱（批号022FA01848G，5 μm，7.8 mm × 300 mm，TOSOH 公司）；IAM（批号SLCC6164，Sigma 公司）；Maurice CE -SDS 应用试剂盒（批号88509，ProteinSimple 公司）（包含CE-SDS 实验中涉及的SDS 样品缓冲液，试液耗材）。

IgG4 型类似药工作对照品（批号RS-001-20211201，用于方法开发和验证）；注射液（批号20220101、20220303、20220305），均由南京正大天晴制药有限公司提供。IgG4 型原研（emicizumab，罗氏。批号B3002B05、B3002B03、B4107B04）。

2 方法与结果

2.1 SE-HPLC 分析

设定流速为0.8 mL/min，采用流动相（100 mmol/L PB+200 mmol/L NaCl，pH 为6.8）通过色谱柱展开检测分析。蛋白上样量为20 μg，记录22 min的采集峰图，然后计算抗体纯度。

SE-HPLC 检测到了0.3%比例的高分子量物质，但未能将碎片与主峰分离。为了实现对纯度的全面分析，还需借助CE-SDS 法进一步加以测定。

2.2 CE-SDS 的建立及优化

2.2.1 初始方法

样品制备：将工作对照品用超纯水稀释至4 mg/mL。取20 μL 稀释后的溶液，将其与75 μL SDS样品缓冲液和5 μL 250 mmol/L IAM 混匀后于70℃的条件下加热10 min。冷却至室温后通过96 孔板后再次离心。

电泳分析：于4 600 V 下进样20 s；分离为5 750 V 后维持60 min。样品仓温度为10 ℃，于220 nm 的检测波长下进行检测。采用面积归一法计算抗体纯度。

所有峰均在42 min 内出峰。为提高检测效率，将分离时间优化至42 min。主峰信号值超出30～50 mAU 为仪器的最佳检测范围，需对检测样品的浓度进行调整。

2.2.2 检测样品终浓度的优化

将工作对照品分别稀释至质量浓度为2.5 mg/mL 和1.5 mg/mL，并参照2.2.1 的步骤制备检测样品。1.5 mg/mL 样品组的主峰信号值在最佳范围内，因此优化检测样品最终质量浓度为0.3 mg/mL。

检测到1.5%的高分子量物质的存在。结合SEHPLC 排除抗体存在的可能性，推断其是在制备过程中由游离巯基错配产生的，需进一步优化IAM 浓度以达到对游离巯基的完全封闭。

2.2.3 IAM 烷基化浓度的优化

将250 mmol/L、500 mmol/L 和1 mol/L IAM 的烷基化能力进行对比，结果如图1 所示。在IAM 的三种浓度下，高分子量物质的含量分别为1.5%、0.8%和0.2%。为提升封闭效果，将IAM 浓度优化为1 mol/L。

图1 IAM 烷基化浓度的优化

2.2.4 加热变性条件的优化

抗体的加热变性条件也需要优化。在保证其完全变性的同时还需避免过度处理，以确保结果能得到真实反馈，具体需考虑加热温度和时长。

首先考察加热温度的影响。经60 ℃处理后检测到未完全变性的抗体峰，表明加热温度过于温和。而80 ℃又过于剧烈，碎片含量显著增加。因此选择70℃作为变性温度。

基于70 ℃加热处理，进一步考察加热时长的影响。处理5 min 时检测到有未完全变性的抗体峰，15 min 时碎片峰含量显著增加。经对比，确定10 min 的加热时长最佳，故选择最适当的变性条件为70℃下加热处理10 min。

2.3 CE-SDS 的验证

2.3.1 线性

将样品稀释至0.75～3 mg/mL（对应50%～200%的线性浓度点），制备检测样品并进行三次平行分析。主峰面积平均值Y（μv·s）对样品质量浓度X（mg/mL）的回归方程为：Y=6.613×108X+2.147×107。相关系数为R=0.999。且各点三次结果的抗体纯度SRSD均不超过0.47%，表明该方法的线性范围宽，灵敏度高。

2.3.2 精密度

实验人员1 平行制备六份检测样品，抗体纯度SRSD为0.20%，该方法具有良好的重复性。与实验人员2 配制的六份样品一起进行检测，结果显示十二次结果抗体纯度的SRSD为0.23%，表明该方法的精密度良好。

2.3.3 溶液的稳定性

检测样品于样品仓中在10 ℃的条件下放置，分别在0 h、6 h、24 h、30 h、48 h 时进行进样测定。抗体纯度无明显差异，SRSD为0.09%。表明检测样品在10℃条件下放置，方法的检测窗为48 h。

2.4 样品检测

SE-HPLC 检测到emicizumab 和类似药高分子量物质含量的范围分别为0.2%～0.3%和0.4%～0.5%，均未检测到碎片。CE-SDS 检测到emicizumab高分子量物质和碎片的含量分别为0.3%～0.4%和1.3%～1.7%；而该方法下类似药的对应含量分别为0.4%～0.6%和1.5%～1.7%。

经过分析确定类似药与原研emicizumab 在纯度方面具有质量相似性，且进一步证实了CE-SDS用于碎片检测的优势。

3 讨论

抗体药物质量的不均一性使研究者需要从多个维度对其进行质量分析。针对其纯度特性，SEHPLC 的单一方法无法同步实现对高分子量物质和碎片的良好表征。而CE-SDS 作为基于不同原理的分离手段，在碎片分析上有着不可替代的优势。

根据抗体分子本身的差异和不同品牌毛细管电泳仪的区别，最适的CE-SDS 方法参数需优化后才能确定。本研究针对IgG4 型生物类似药，在Maurice电泳仪上建立了CE-SDS 检测方法，并对一系列方法参数进行了优化，还结合SE-HPLC 确定了初始条件下较高比例的高分子量物质是由游离巯基错配产生的。经验证，该方法具有可实用性。

结合CE-SDS 和SE-HPLC 两种方法评价类似药与原研纯度特性的相似性，表明CE-SDS 法可应用于放行和表征等研究中。

综上所述，本文建立的方法适用于IgG4 型艾美赛珠单抗生物类似药的纯度分析，对于其他类似药的纯度分析也具有一定的参考意义。