一株枯草芽孢杆菌进行饲料固态发酵的条件优化

杨润蕾，张美如，高雪慧，汪 卓，张秀敏，2，3

1.河北大学生命科学学院，河北 保定 071000；2.河北省微生物育种与保育工程实验室，河北 保定 071000；3.河北省微生物多样性研究与应用重点实验室，河北 保定 071000

枯草芽孢杆菌是最为常见的发酵菌株之一，其具有抗逆性强的特点，能够分泌多种消化酶和有机酸，可以拮抗致病菌，改善饲料营养结构，而且经枯草芽孢杆菌发酵过的饲料也具有独特的色、香、味，饲料适口性得到显著改善[1]。

本试验选用一株枯草芽孢杆菌对蛋鸡配合饲料基础料进行固态发酵，通过对发酵条件进行优化，提高发酵产物中酸溶蛋白含量等指标，并探讨发酵过程的规律，优化发酵工艺，以期为进一步提高固态发酵饲料品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用的枯草芽孢杆菌菌株B591 为河北省微生物育种与保育工程实验室分离并保存。

枯草芽孢杆菌活化采用NA 培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 15.0 g，琼脂20.0 g，水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

NB 培养与NA 培养基配方相同，但不加琼脂。

蛋鸡配合饲料基础料组成：玉米粉60%，豆粕25%，麸皮15%。

发酵基础条件：添加硫酸铵2%，物料含水量40%，接种量1×109CFU/kg，初始pH 自然状态（大约为6.6），发酵温度为室温（约23～27 ℃），发酵12 d。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的培养

将枯草芽孢杆菌菌株B591 接种到NA 斜面培养基中，28 ℃条件下培养2 d，再接种到NB 液体培养基中，28 ℃条件下振荡培养2 d。取种子液按照一定接种量接入固态发酵基料中。

1.2.2 单因素实验

选取发酵时间（6、8、10、12、14 d）、发酵初始pH（6.0、6.5、7.0 和7.5）、料水比（1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8 和1∶0.9）、接种量（1.0×108CFU/kg、2.0×108CFU/kg、3.0×108CFU/kg、4.0×108CFU/kg、5.0×108CFU/kg）、硫酸铵添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）5 个因素分别开展单因素实验。

1.2.3 正交试验

通过上述单因素优化试验结果，以发酵时间A、接种量B 和物料含水量C、硫酸铵添加量D 为因素，每个因素设置3 个水平，进行L9（34）正交试验设计（见表1）。

表1 L9（34）正交设计表

1.2.4 相关指标检测

（1）枯草芽孢杆菌有效活菌数的测定

取1.0 g 样品加入99 mL 无菌水中，摇床振荡20～30 min，梯度稀释，于85 ℃下水浴20～30 min；取100 μL 稀释后的样品，涂布到NA 培养基平板上，培养2 d 后计数。

（2）pH 的测定

称取10.0 g 发酵饲料加到90 mL 蒸馏水中，振荡30 min，静置10 min 后，利用pH 计测定上清液的pH[2]。

（3）粗蛋白及酸溶蛋白含量的测定

取0.5 g 发酵饲料样品加入消煮管中，采用凯氏定氮法测定饲料中的粗蛋白含量，具体测定方法详见GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定》。取新鲜样品3 g（精确至0.001 g），再加入25 mL 15%的三氯乙酸浸提4 h，10 000 r/min 离心5 min，取5 mL 上清液于消煮管中[3]，采用凯氏定氮法测定饲料中酸溶蛋白含量，具体测定方法详见NY/T 3801—2020《饲料原料中酸溶蛋白的测定》。

1.2.5 数据分析

各项指标测定均保证3 个样品平行，试验数据使用Excel 2019 和SPSS 软件进行统计，用单因素方差分析（ANOVA）进行分析，组间多重比较采用Duncan's 分析进行差异显著性检验，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 发酵时间对发酵的影响

分别在发酵2、4、6、8、10、12、14 d 时测定发酵料的pH、有效活菌数及酸溶蛋白/粗蛋白相对含量。发现在发酵前8 d，pH 下降得较快，到14 d 时pH为4.33。在发酵10 d 时，枯草芽孢杆菌的有效活菌数达到最大值，为2.05×108CFU/g。酸溶蛋白/粗蛋白相对含量逐步上升，12 d 后上升逐渐趋于平缓，到14 d 时相对含量为32.69%。故选取发酵时间10、12、14 d 进行正交优化。

2.1.2 发酵初始pH 对发酵的影响

发酵初始pH 为6.5 时，酸溶蛋白/粗蛋白相对含量最高，此pH 与物料自然pH 较为接近，便于进行发酵，故后续可选pH 自然状态。

2.1.3 料水比对发酵的影响

在料水比为1∶0.6 时，酸溶蛋白/粗蛋白相对含量最高，随着料水比的逐渐增大，酸溶蛋白/粗蛋白的相对含量逐渐下降。因此，选择料水比1∶0.5、1∶0.6 和1∶0.7 为正交优化的参数。

2.1.4 接种量对发酵的影响

选取接种量3×108CFU/kg、6×108CFU/kg、9×108CFU/kg 进行正交优化。

2.1.5 硫酸铵添加量对发酵的影响

在硫酸铵添加量为2%时，酸溶蛋白/粗蛋白相对含量最高，故选择硫酸铵添加量1.5%、2%和2.5%为正交优化的参数。

2.2 正交优化结果

根据表1 设计的正交条件开展正交实验，测定各实验条件下的酸溶蛋白/粗蛋白相对含量，结果见表2。

表2 正交优化结果

由表2 可知，极差RA>RD>RC>RB，即4 个因素中，发酵时间对酸溶蛋白/粗蛋白相对含量的影响最大，其次为硫酸铵添加量和料水比，接种量影响较小。故最优条件为A3B2C1D3，即发酵时间为14 d，接种量为6×108CFU/kg，料水比为1∶0.5，硫酸铵添加量为2.5%。

在上述优化发酵条件下发酵14 d 后，取样测定发酵基料和发酵饲料的各指标见表3。相较于发酵基料，发酵后饲料的pH 显著降低，枯草芽孢杆菌的有效活菌数可达到1829×108CFU/kg，酸溶蛋白/粗蛋白含量达到33.66%。

表3 优化发酵条件下的发酵基料和发酵饲料比较

3 讨论

经过发酵后，发酵饲料中产生了乳酸、乙酸等多种有机酸，使物料pH 显著降低，从而抑制了真菌的生长，同时使发酵饲料具有酸香味，可以改善饲料的适口性，提高动物的采食率，还可在进入动物肠道后降低肠道环境pH，抑制有害菌的生长，提高动物健康水平[4]。本研究中经过发酵的饲料pH 明显降低。

本研究中酸溶蛋白/粗蛋白相对含量显著提高，一方面是因为饲料中的非蛋白氮可以转换成蛋白质；另一方面是饲料中的非蛋白物质出现损耗，蛋白质在饲料中的百分比得到提高[5]。

4 结语

通过对枯草芽孢杆菌B591 对蛋鸡配合饲料基础料固态发酵条件进行优化，得到最优发酵条件为：发酵时间为14 d，接种量为6×108CFU/kg，料水比为1∶0.5，硫酸铵添加量为2.5%；并测定了优化发酵条件下的发酵饲料质量，可知pH 显著降低，有效活菌数可达到1.83×1011CFU/kg，酸溶蛋白/粗蛋白含量达到33.66%。