毕赤酵母水解工艺的研究

袁稚雯，王士岩，2，朱小燕，2*，李相前，2*

1.淮阴工学院生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003；2.江苏省益生制剂重点建设实验室，江苏 淮安 223003

毕赤酵母（Pichia pastoris）作为单细胞真核生物之一，是能利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌[1]。酵母水解物（Yeast hydrolysates，YH）通过酵母与蛋白酶酶解得到，因为酵母细胞内富含蛋白质、矿物质、维生素等营养成分[2]，常用于微生物的培养和发酵[3]。随着国内生物酶制剂的发展，现在可以使用生物酶法提取酵母浸出物和水解物[4]。酶促能够加速细胞壁裂解，使其内部细胞营养物质被大量释放[5]。外加酶能缩短水解时间，提高水解效率，达到酵母细胞壁溶解的目的，多种外加酶一起搭配作用，会有更好的破壁效果[6-7]。目前，我国在研究酵母水解物时，主要采用的方法有：盐溶法、外加酶解法和复合促溶法[8-11]等。因能显著提高酵母细胞营养物质的获得率[12]，减少溶解所需时间，外加酶法已经成为当下的热门使用方法[13]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种：毕赤酵母，为本实验室保藏；

酶制剂：木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶，购买于锐阳生物科技有限公司，详情见表1；

表1 酶解酵母细胞所用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶

培养基配制：

YPD 液体培养基，酵母浸粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，pH 自然，115 ℃灭菌20 min。

YPD 固体培养基，酵母浸粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，琼脂2.0%，pH 自然，115 ℃灭菌20 min。

在超净工作台中，将实验室保藏的毕赤酵母菌株挑取一环菌划线分离于YPD 固体培养基平板上，倒置于恒温培养箱30 ℃培养48～72 h；挑取单个菌落放至5 mL YPD 试管培养基中，进行摇瓶培养，250 r/min，30 ℃，24 h；从5 mL YPD 试管培养基中吸取100 μL 菌液转入100 mL YPD 培养基，进行摇瓶培养，250 r/min，30 ℃，24 h；将100 mL 菌液完全倒入1 L YPD 培养液中，进行摇瓶培养，250 r/min，30 ℃，24 h。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

酵母发酵液→洗涤离心（8 000 r/min）×3 次→洗净的酵母泥→配制酵母悬浮液（包含4% NaCl）→自溶→灭酶（105 ℃，20 min）→冷却离心→水解产物的检测。

1.2.2 测定方法

1.2.2.1 酵母水解物中氨基氮的测定

将5 mL 上清液稀释至100 mL，加水混合；然后，将20 mL 稀释液加入烧杯，并在磁力搅拌器上加入60 mL 水；将0.05%氢氧化钠标准溶液滴到pH 8.2，中和上清液中的游离酸。

加入10 mL 甲醛混合，并将0.05%氢氧化钠标准溶液滴到pH 9.2，以测定氨基酸态氮。

空白实验，在80 mL 水中加入0.05%氢氧化钠标准溶液，并加入10 mL 甲醛，用于比较去氢氧化钠的体积结果。结果将用于评估酵母水解物中游离酸和氨基酸态氮的含量，以研究酵母的代谢特性。

计算公式

式中：X 为样品中氨基氮含量（mg/100 mL）；V1为空白滴定在加入甲醛后滴定至pH 9.2 所用NaOH 标准溶液的体积（mL）；V2为样品稀释液在加入甲醛后滴定至pH 9.2 所用NaOH 标准溶液的体积（mL）；C为氢氧化钠的标准溶液浓度。

1.2.2.2 酵母水解物中固形物的测定

取酵母水解液10 000 r/min 离心10 min，取得5 mL 上清液放置105 ℃烘箱烘干至恒重。

计算公式

式中：M3为酵母在发酵后自溶并产生上清液的总质量（g）；W1为上清液中固体物质的含量（%）；M4为发酵过程中添加到反应中的外加物质（如营养物质等）的干重（g）；M2为发酵前酵母的干重（g）。

1.2.2.3 酵母水解物中蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法测定；样品处理；将酵母水解物置于真空冷冻干燥机至恒重，备用。消化。

称取干燥至恒重的酵母水解物0.1 g，移入干燥凯氏烧瓶中，加入0.2 g 硫酸钾-硫酸铜混合物，并加入消化液5 mL 和玻璃珠1 粒，摇匀；将烧瓶至60°角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，把操作放置于通风橱内，使用电炉加热消化，同时控制火力，不要让液体冲到瓶颈，一般控制在200 ℃；待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，使瓶内液体微微沸腾，大约至400 ℃维持2～3 h；待消化液呈蓝绿色澄清透明状，再继续加热0.5 h；停火冷却后，将消化液移入100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，备用；另取一干燥的凯氏烧瓶，以1 mL 蒸馏水替换干燥的酵母水解物样品作为空白对照，其他操作均相同。

（1）标准硫酸铵样品的蒸馏

先用标准硫酸铵溶液（0.3 mg N/mL）实验2～3次；取3 个50 mL 的锥形瓶，分别准确加入2%硼酸5～10 mL，加入混合指示剂；用表面皿覆盖备用；用吸量管吸取1 mL 标准硫酸铵溶液，由加样漏斗倾入至反应室，再用1 mL 蒸馏水清洗漏斗；取1 个盛有硼酸-混合指示剂的锥形瓶，置于冷凝管下端，使冷凝管器管口下端浸没在硼酸溶液的液面下，用量筒从漏斗加入30%氢氧化钠5～10 mL，随即将自由夹夹紧，漏斗加入少量蒸馏水作水封；加热蒸汽发生器使其产生蒸汽，待第1 滴蒸馏液从冷凝柱下端滴下时，继续蒸馏5 min，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再继续蒸馏2 min，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管口外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。

（2）样品消化液及空白液的蒸馏

取50 mL 锥形瓶数个，各加入2%硼酸溶液5～10 mL 和指示剂1～2 滴，用表面皿覆盖备用；用吸量管分别吸取5～10 mL 样品消化液和空白液，按照上述操作步骤进行蒸馏。

滴定：蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，分别以0.010 0 mol/L HCl 标准溶液滴定，待锥形瓶内液体的颜色由蓝绿色变为灰红色（或淡紫色），即滴定终点。分别记录样品消化液蒸馏物及空白消化液蒸馏物的HCl 使用量，分别为V1和V2。

计算公式

式中：X 为样品中蛋白质的含量（%）；V1为加入样品后消耗的盐酸标准液体积（mL）；V2为空白实验消耗盐酸标准液的体积（mL）；C 为盐酸标准溶液的摩尔浓度，表示单位体积中含有盐酸的物质的量（mol/L）；0.014 为每毫升盐酸标准溶液中相当于氮的克数；m 为样品的质量（g）；F 为氮换算为蛋白质的系数为6.25。

2 结果与讨论

2.1 自溶对毕赤酵母破壁的影响

2.1.1 不同温度对毕赤酵母自溶破壁的影响

由图1 可知，在其他影响因素保持不变的情况下，温度为50 ℃时，酵母细胞具有最高的氨基氮和固形物得率，这是细胞内酶活性的最佳温度。因此，本实验中的最佳破壁温度为50 ℃，此时细胞具有最佳的破壁效果。

图1 不同温度对毕赤酵母自溶破壁的影响

2.1.2 不同pH 对毕赤酵母自溶破壁的影响

由图2 可知，在其他影响因素保持不变的情况下，当pH 为6.0 时，酵母细胞释放的氨基氮和固形物得率最佳。因此，最适破壁的pH 为6.0。

图2 不同pH 对毕赤酵母自溶破壁的影响

2.1.3 不同悬浮液底物体积分数对毕赤酵母自溶破壁的影响

由图3 可知，体积分数为10%时，自溶破壁效果最佳，酵母细胞的氨基氮和固形物得率最高。因此，本实验中的最佳破壁悬浮液底物体积分数为10%。

图3 不同悬浮液底物体积分数对毕赤酵母自溶破壁的影响

2.1.4 不同作用时间对毕赤酵母自溶破壁的影响

由图4 可知，在其他影响因素保持不变的情况下，当作用时间为30 h 时，酵母细胞的氨基氮和固形物得率最高。因此，本实验中的最佳作用时间为30 h。

图4 不同作用时间对毕赤酵母自溶破壁的影响

2.2 不同蛋白酶对毕赤酵母水解的影响

实验研究表明，相对于其他蛋白酶水解的研究，使用木瓜蛋白酶的效果最好。如图5 所示，氨基氮得率为4.5%，固形物得率为59%。表2 可见，国际水解蛋白委员会关于酵母水解物化学指标中，对氨基酸的建议标准为>3.5%（不含NaCl），添加木瓜蛋白酶的效果能达到此标准，经木瓜蛋白酶水解产物的粗蛋白含量为45.38%。国际水解蛋白委员会对于酵母水解物化学指标当中总氮的建议标准为>9.0%（不含NaCl），因此，添加木瓜蛋白酶的效果能达到此标准。

图5 不同蛋白酶自溶水解的影响

表2 酵母水解物的化学指标

2.3 木瓜蛋白酶水解条件的优化

2.3.1 添加量

蛋白酶的添加量对酵母自溶破壁存在一定影响，添加量不同对其破壁的影响程度不同。由图6 可知，当木瓜蛋白酶的添加量在0.5%时，氨基氮得率为4.2%，固形物得率56%。故确定木瓜蛋白酶的添加量为0.5%。

图6 木瓜蛋白酶的添加量对酶促溶的影响

2.3.2 pH

木瓜蛋白酶pH 在5.0～7.0，不同的pH 对其破壁的影响程度不同。由图7 可知，pH 在6.0 时，氨基氮得率为4.0%，固形物得率55%。故确定pH 对木瓜蛋白酶的影响在6.0。

图7 pH 对木瓜蛋白酶酶促溶的影响

2.3.3 温度

木瓜蛋白酶的适宜温度在50～58 ℃，不同温度的影响如图8 所示。当温度在52 ℃时，氨基氮得率为4.5%，固形物得率为60%。故确定在52 ℃下木瓜蛋白酶作用效果最佳。

图8 温度对木瓜蛋白酶酶促溶的影响

2.3.4 作用时间

作用时间对于木瓜蛋白酶酶活起到的作用也不同，如图9 所示。在作用时间为30 h 时，木瓜蛋白酶的酶活发挥最高价值，其氨基氮得率为4.5%，固形物得率为59%。相比其他作用时间，30 h 是最佳时间。

图9 作用时间对木瓜蛋白酶酶促溶的影响

3 结论

研究发现毕赤酵母的自溶水解条件在50 ℃、pH 6.0，作用时间为30 h、4% NaCl，酵母悬浮液终体积分数为10%最佳，氨基氮得率为2.2%，固形物得率为30%。木瓜蛋白酶（8×105U/g）在添加量为0.5%、52℃、pH 6.0、作用时间30 h、4% NaCl、酵母悬浮液终体积分数为10%的氨基氮得率为4.5%，固形物得率为59%，粗蛋白含量为45.38%。