SMAD7、SMAD9与肺腺癌患者预后及免疫浸润的相关性分析

李晓武, 张有为, 冯 玉, 韩 亮, 袁 媛

(徐州市中心医院肿瘤内科, 江苏 徐州 221000)

肺腺癌属于非小细胞肺癌,肺腺癌的发病率约占所有肺癌病例的40%,是最具侵袭性的肿瘤类型之一,预后差,患者总生存期不到5年[1]。肺癌组织中的肿瘤细胞、免疫细胞、多种基质细胞共同组成免疫抑制微环境,肿瘤免疫抑制微环境会直接影响患者预后[2]。据报道,肿瘤浸润的免疫细胞与非小细胞肺癌的预后有关,可通过分析免疫细胞浸润的模式对预后进行预测[3]。SMAD蛋白是一种胞内信号分子,可对转化生长因子-β信号传导进行调节,转化生长因子-β在细胞发育和致癌过程中发挥关键作用[4]。有研究发现转化生长因子-β可以促进人肺腺癌细胞株增值[5]。目前已发现至少9种SMAD蛋白[6]。按照抑制或调节转化生长因子-β家族的信号传导分为体激活型、共同型和抑制型3类,其中SMAD7、SMAD9的研究较少[7-8]。基于此,本研究旨在探讨SMAD7、SMAD9在肺腺癌预后中的价值及其与免疫浸润的相关性。

1 资料与方法

1.1 材料与试剂TakaraRNA提取试剂盒(9767)、Takara反转录试剂盒(D6110A)、Takara TB Green®Fast qPCR Mix(RR430S)。

1.2 差异基因筛选GEPIA数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)用于预测SMAD家族9个家族成员在肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)中的表达水平,GEPIA数据库中的信息来自于TCGA和GTEx,其中包含483份LUAD组织的信息以及347份配对癌旁正常组织的信息。此外借助GEPIA数据库预测SMAD7、SMAD9表达水平对肺腺癌患者生存的影响。

1.3 免疫浸润相关性分析TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)用于预测SMAD家族中差异表达明显的成员与免疫细胞(B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞)浸润水平的相关性。GEPIA数据库用于分析SMAD家族中差异表达明显的成员与免疫细胞标志物的相关性。

1.4 受试者资料收集2016年4月至2017年4月在徐州市中心医院纳入108例行手术治疗的肺腺癌患者标本,手术切除癌组织与癌旁组织并立即在液氮中冷冻保存。其中男性患者63例,女性患者45例,平均年龄(52.11±9.36)岁。纳入标准:病理学确诊为肺腺癌,未接受过放疗或化疗等其他辅助性治疗,临床资料完整。排除标准:病理学诊断为其他类型肺癌患者,合并其他肿瘤患者,具有手术禁忌证无法进行手术治疗患者,临床资料不全及失访患者。所有患者及其家属对研究内容知晓并签署书面知情同意书,本研究经过徐州市中心医院伦理委员会批准(审批号:XZXY-LJ-20200110-091)。

1.5 qRT-PCR检测SMAD7和SMAD9的mRNA表达取待测组织,使用RNA提取试剂盒提取待测组织的总RNA。用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,而后使用TB Green®Fast qPCR Mix(RR4305)进行real-time PCR检测。具体实验步骤见以上试剂盒的说明书。SMAD7引物序列:正向5′-ACAA-CCGCAGCAGTTACCC-3′,反向5′-TCGAAAGCCTTGATGGA-3′, SMAD9引物序列:正向5′-CT-ACCGTCTGCAAGATCCCC-3′,反向5′-AGCACCCCAACCCTTAACAAA-3′,GAPDH内参引物序列:正向5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,反向5′- GGCATGGACTGTGGTACATGAG-3′。 用2-△△Ct法计算SMAD7、SMAD9相对表达水平。

1.6 预后分析根据SMAD7和SMAD9表达的平均数将患者分为SMAD、SMAD9高表达组和低表达组,对比患者生存时间。Cox比例风险模型分析影响患者生存时间的独立预测因素,5年随访结束,死亡患者为阳性事件记作“1”,生存患者记作“0”。HR为风险函数值比值,当HR>1时,提示暴露因素是阳性事件的促进因素,HR<1时,提示暴露因素的阳性事件的阻碍因素,HR=1时,提示暴露因素对阳性事件无显著影响。

2 结果

2.1 SMAD家族成员在肺腺癌组织中的差异表达水平比较GEPIA数据库预测结果显示,相对于正常组织样本,SMAD7、SMAD9在癌组织样本中的表达降低(P均<0.05),见图1。

注: A, SMAD7在正常组织与癌组织样本中的表达; B, SMAD9在正常组织与癌组织样本中的表达。图1 GEPIA数据库预测SMAD家族成员在正常组织与肺腺癌组织样本中差异表达图

2.2 SMAD7、SMAD9的表达水平与肺腺癌患者预后的关系分析结果GEPIA数据库预测结果显示SMAD7、SMAD9低表达水平的患者总生存率低于SMAD7、SMAD9高表达水平的患者(P均<0.05),见图2。

注: A, SMAD7表达水平对肺腺癌患者生存的影响; B, SMAD9表达水平对肺腺癌患者生存的影响。图2 GEPIA数据库预测SMAD7、SMAD9表达水平对肺腺癌患者生存的影响图

2.3 SMAD7、SMAD9与免疫细胞浸润水平的关系分析结果TIMER网站预测结果显示,SMAD7与B细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞水平均呈正相关(P均<0.05),与CD8+T 细胞的水平无相关性,SMAD9与B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞水平呈正相关(P均<0.05),与CD8+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞的水平无相关性。见图3。

2.4 SMAD7、SMAD9与免疫细胞标志物的相关性分析结果GEPIA数据库显示SMAD7与CD115、CD86、CD68、CCL2、IRF5呈正相关(P均<0.05),SMAD9与CCL2、IRF5呈正相关(P均<0.05)。见表1。

表1 SMAD7、SMAD9与免疫细胞标志物的相关性预测结果

2.5 SMAD7、SMAD9在肺腺癌患者癌组织中的表达检测及其预后分析结果qRT-PCR检测肺腺癌患者癌旁组织与癌组织中SMAD7、SMAD9的表达水平显示,相对于癌旁组织中SMAD7(1.00±0.27)、SMAD9(1.00±0.31)的表达,癌组织中SMAD7(0.76±0.24)、SMAD9(0.81±0.22)的表达降低(P均<0.05),见图4A。以平均数(SMAD7:0.79,SMAD9:0.85)作为界限,分为SMAD7高表达水平患者(54例)与低表达水平患者(54例),SMAD9高表达水平患者(55例)与低表达水平患者(53例)。SMAD7高表达水平患者和低表达水平患者、SMAD9高表达水平患者和低表达水平患者的一般资料差异无统计学意义(P均>0.05),见表2。Kaplan-Meier分析结果显示,SMAD7、SMAD9低表达患者的5年总生存率低于高表达患者(P均<0.05),见图4B、 4C。

表2 SMAD7、SMAD9表达与患者一般资料的关系

注: A, qRT-PCR检测SMAD7与SMAD9在癌旁组织与癌组织中相对表达水平; B, SMAD7表达水平对肺腺癌患者生存的影响; C, SMAD9表达水平对肺腺癌患者生存的影响。***P<0.001。图4 qRT-PCR检测及生存分析图

2.6 影响肺腺癌患者生存时间的多因素分析结果Cox分析结果显示,淋巴结转移、T3+T4分期、组织学 Ⅲ 级与SMAD7、SMAD9水平是影响肺腺癌患者总生存时间的独立风险因素(P均<0.05)。见表3。

表3 影响肺腺癌患者生存时间的Cox多因素分析结果

3 讨论

本研究结果显示SMAD7、SMAD9低表达水平的肺腺癌患者总生存率低于高表达水平肺腺癌患者,与GEPIA数据库预测预测具有一致性。一方面原因可能是:SMAD家族是转化生长因子-β信号传导的关键分子,参与细胞转化、合成、凋亡、侵袭转移等生物学过程[9];LASP1调控转化生长因子-β/SMAD信号通路,影响SMAD7蛋白水平,诱导肺癌上皮间质转化[10];上皮间质转化是肺腺癌发生发展的分子机制之一,转化生长因子-β1可促进上皮间质转化,SMAD7转染则能抑制上皮间质转化[11]。另一方面原因可能是:竞争性内源RNA机制作用,如miR-21-5p通过降低SMAD7的表达促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[12];SMAD9是骨形态发生蛋白信号通路中的一种新型转录调控因子,骨形态发生蛋白是转化生长因子-β家族的一种,SMAD9的表达通过骨形态发生蛋白信号的激活而增加,可降低骨形态发生蛋白的活性[13]。陈东姣等[14]研究发现肺腺癌肿瘤组织的SMAD9基因的mRNA表达显著低于癌旁正常组织,并且肺腺癌患者中SMAD9基因低表达患者生存时间显著低于高表达患者的生存时间。与本研究的结果一致。

免疫细胞浸润与非小细胞肺癌的发生和发展存在关联[15]。本研究结果表明,SMAD7与B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的水平呈正相关,而与CD8+T细胞和树突状细胞的水平无相关性;SMAD9与B细胞、CD4+T细胞和巨噬细胞的水平呈正相关,但与CD8+T细胞、中性粒细胞和树突状细胞的水平无相关性。提示,SMAD7和SMAD9在调节免疫系统中的特定细胞类型中起着不同的作用。例如,SMAD7和SMAD9与B细胞、CD4+T细胞和巨噬细胞水平呈正相关,推测SMAD7和SMAD9在这些细胞中参与了正调节的免疫反应。与CD8+T细胞、中性粒细胞和树突状细胞水平无相关性,表明SMAD7和SMAD9对这些细胞可能没有直接的调节功能。

本研究显示SMAD7与免疫细胞标志物CD115、CD86、CD68、CCL2、IRF5呈正相关,SMAD7仅与CCL2、IRF5呈正相关。IRF5对肿瘤的发生起抑制作用[16],激活的树突状细胞及M1 型巨噬细胞均与肺腺癌患者较差的预后相关[17]。提示,检测SMAD7、SMAD9在癌组织中的表达量对于预后免疫浸润有一定的价值。有研究报道,肿瘤微环境中的多项因素可促使恶性肿瘤的复发和转移[18]。本研究Cox分析结果显示,淋巴结转移、T3+T4分期、组织学Ⅲ级与SMAD7、SMAD9水平是影响肺腺癌患者总生存时间的独立预测因子,提示SMAD7、SMAD9有望成为肺腺癌预后评价的生物标志物。

综上所述,本研究发现肺腺癌组织中的SMAD7和SMAD9表达水平降低,并且与免疫浸润水平以及免疫细胞标志物相关。本研究还存在一些局限性和不足之处。首先,本研究的样本量相对较小,可能存在潜在的选择性偏倚;其次,本研究主要关注SMAD7和SMAD9的表达水平与肺腺癌预后的相关性,但并未深入研究其具体的分子机制。今后将可扩大样本量并开展相关分子机制研究以验证本研究结论的可靠性。