甜高粱苗期镉耐性和富集能力综合评价

黄 娟,周 瑜,张亚勤,李泽碧,王秋月,奚 江,吴修林

(重庆市农业科学院特色作物研究所,重庆 402160)

近年来,耕地重金属污染日益严重[1],其中,镉(Cadmium,Cd)分布广泛,易被作物吸收并积累,降低产量和品质,并通过食物链在人体富集,严重威胁人类健康[2-3],为重金属污染物之首[4]。因此,Cd污染土壤的修复与安全利用已迫在眉睫。治理Cd污染的方式有多种,而植物修复是修复重金属污染土壤最经济、绿色的途径[5]。甜高粱(SorghumbicolorL.)具有抗逆性强、生长快、生物量高、光合效率高、生产成本低等优势[6-7],在全球广泛种植,是公认的生物能源作物。甜高粱能够通过根系吸收土壤中的重金属,并转移到地上部,从而修复污染土壤[8]。另外,修复后的甜高粱可以用于生产生物乙醇,作为能源不进入食物链[9],因此,甜高粱是Cd污染土壤植物修复最具前景的作物。

不同作物对Cd的耐性不同,花生(Arachishypogaea)和油菜(Brassicanapus)强于大豆(Glycinemax),棉花(Gossypiumhirsutum)强于红麻(Hibiscuscannabinus)和苎麻(Boehmerianivea)[10],亚香茅(Cymbopogonnardus)强于象草(Pennisetumpurpureum)[11]。高粱具有较强的Cd耐受性,明显强于小麦(Triticumaestivium)、玉米(Zeamays)和豆角(Canavaliaensiformis)[12-13],在低浓度Cd处理下持续胁迫30天也能基本保持正常生长[14]。高粱不同基因型间的耐Cd性差异较大,品种间的耐Cd指数最大差异可达8.7倍多。耐Cd性更强的品种才能在Cd污染土壤中正常生长[15],因此,评价甜高粱品种耐Cd性,筛选出强耐Cd性甜高粱品种,是利用甜高粱修复Cd污染土壤的前提。

高粱具有把Cd从土壤吸收到植株中的高富集能力以及从根部转移到茎的高转移能力[16],从而消减土壤中的Cd含量。不同高粱种质对重金属的吸收、转移及储存能力差异显著[17]。‘辽甜1号’对Cd的吸收能力强于‘新高粱3号’[18],对Cd的富集系数高于‘XT-2’[19]。高丹草(Sorghumhybridsudangrass)对Cd的富集能力强于‘大力士’和苏丹草(Sorghumsudanense)[20]。Jia等[15]发现,Cd总吸收量和转移系数最高的甜高粱品种比最低的均高4.2倍,选择Cd富集能力强的基因型,能够提高修复效率。因此,筛选富集转移性高的品种是利用甜高粱修复Cd污染土壤的关键。

然而,现有研究对甜高粱Cd修复能力的评价仅从耐Cd性或Cd富集能力一个方面进行,二者缺乏有机结合,综合评价体系尚不健全。本试验采用沙培法,分析26份甜高粱品种幼苗在Cd胁迫下生长特性和生理指标的变化,运用多种统计方法对甜高粱的耐Cd性进行综合评价,同时对甜高粱品种的Cd富集系数和转移系数进行比较,筛选出耐Cd性强、富集转移性高的甜高粱品种,以期为利用甜高粱修复Cd污染土壤提供优异材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用26个甜高粱品种,品种名称及来源见表1。

表1 供试高粱品种及来源Table 1 Sweet sorghum varieties and their origins

1.2 试验设计

挑选健康饱满、大小均匀的甜高粱种子,经自来水反复冲洗后,用75%酒精消毒5 min,去离子水冲洗3次,并浸泡4 h,而后放入铺有两层滤纸的培养皿中,置于28℃恒温箱培养箱内催芽。将露白后的种子均匀播种于装有等量1.5 kg (以干重计)细砂的塑料花盆(上口径15 cm,底部直径10 cm,高14 cm)中,每盆播10粒种子,置于温度为25℃/20℃(昼/夜),相对湿度为50%～60%,光照周期为14 h/10 h (昼/夜)的温室中培养。每天浇水1次,以浇透为准,出苗后每隔1 d浇施1/2 Hoagland营养液100 mL。待幼苗长至3叶1心时,每盆定苗5株。然后开始Cd胁迫处理,设置2个Cd处理水平,即细砂中Cd2+含量分别为0 (CK)和5 mg·kg-1,称取152.679 mg的CdCl2·2.5H2O与Hoagland营养液配置成1 000 mL的溶液,每盆浇100 mL,使其土壤最终Cd2+含量达到5 mg·kg-1,CK浇灌等量的Hoagland营养液,每个处理6次重复。胁迫期间每隔1 d浇施Hoagland营养液100 mL,为防止Cd2+流失,花盆下垫塑料托盘,将渗出的溶液再返倒回花盆的土中。Cd处理21 d后取样并测定相关指标。

1.3 指标测定

1.3.1生长指标的测量 每盆选择3株具有代表性的植株,3次重复,共9株,小心从细砂中取出完整植株,先用自来水冲洗,根系洗净后用20 mmol·L-1的Na2EDTA溶液浸泡15 min,再用去离子水冲洗3次,滤纸吸干,在根茎结合处剪断,将植物分为茎叶部和根部,测定生长指标。株高(Plant height,PH)：用米尺测量植株基部到上部最长叶叶尖的距离。根长(Root length,RL)：用米尺测量植株基部到根系下端最长距离。根部鲜重(Roots fresh weight,RFW)和茎叶部鲜重(Shoots fresh weight,SFW)：用千分之一天平称量其鲜重。然后置烘箱105℃杀青30 min,65℃下烘干48 h以上至恒重,分别用千分之一天平再称量根部干重(Root dry weight,RDW)和茎叶部干重(Shoots dry weight,RDW),再用不锈钢粉样机分别粉碎备测。

1.3.2生理指标的测定 每盆选择3株具有代表性的植株,3次重复,共9株,取倒数第1片完全展开叶进行各项生理指标测定。叶绿素(Chlorophyll content,Chl)含量的测定利用SPAD-502Plus便携式仪测定叶绿素相对含量[21]。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量参照杨柳等[22]方法,采用试剂盒(购自苏州科铭生物技术有限公司,货号为SOD-1-Y、POD-1-Y和MDA-1-Y)测定。

1.3.3Cd含量的测定 取烘干的植株样品,准确称取0.1 g,置于聚四氟乙烯消煮管中,将样品在HNO3∶H2O2=5∶1(体积比,v/v)中消化直至完全澄清。去离子水稀释后,用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,Plasma Quant®MS,德国)测定。

重金属富集系数和转移系数的计算公式[23]为：

1.4 数据分析

为了消除不同品种间固有差异对测量结果的影响,各生长和生理指标均采用耐Cd指数来反映不同甜高粱品种的耐Cd性,即耐Cd指数X=某一指标Cd胁迫处理组测定值/对照组测定值[24]。

在耐Cd性综合评价过程中,首先对各个单项指标的耐Cd指数进行主成分分析,从中选取能够代替原有指标的主成分,然后计算出各品种在各主成分下的综合指标值,在此基础上再计算出各品种各综合指标的隶属函数值,最后根据各综合指标权重计算出耐Cd性综合评价值D值,以此确定各品种耐Cd性的强弱。相关计算公式如下[25-26]：

(1)

(2)

(3)

(4)

式(1)中,Cij表示第i品种的第j个综合指标值,Zij为各单项指标耐Cd指数的特征值所对应的特征向量,Xij为第i品种的第j指标的耐Cd指数。

式(2)中,Uij表示甜高粱第i品种的第j个综合指标的隶属函数值;Cjmin和Cjmax分别为所有参试材料第j个综合指标的最小值和最大值。

式(3)中,Wj为第j个综合指标在所有综合指标中的权重;Vj为各品种第j个综合指标的贡献率。

式(4)中,D值为由生长和生理指标确定的耐Cd能力综合评价值,该值越大表明品种耐Cd性越强,反之耐Cd性越弱[27]。

采用Microsoft Excel 2010整理数据,SPSS 20.0软件进行统计分析、主成分分析、隶属函数分析和聚类分析。采用Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫对不同甜高粱品种苗期的影响

方差分析结果可知(表2),10项指标在甜高粱品种和Cd处理间均存在极显著差异(P<0.01)。由表3可知,与对照相比,Cd胁迫下甜高粱幼苗的根长、株高、根鲜重、根干重、茎叶鲜重、茎叶干重、叶绿素含量分别降低16.614%,11.263%,16.603%,23.889%,15.734%,11.450%,19.050%,POD活性、SOD活性和MDA含量分别升高38.832%,21.758%和102.605%,表明MDA含量对Cd胁迫更敏感。Cd胁迫下,10项指标的变异系数均在10%以上,其中SOD活性最高,叶绿素含量最低。

表2 不同处理下各甜高粱品种幼苗性状的方差分析Table 2 Variance analysis of seedling traits of sweet sorghum varieties under different treatments

表3 不同处理对甜高粱品种幼苗性状的影响Table 3 Effects of different treatments on the seedling traits of sweet sorghum varieties

2.2 不同甜高粱品种耐Cd性评价

2.2.1不同甜高粱品种的耐Cd性差异 由表4可知,不同甜高粱品种的单项耐Cd指数差异明显,除根鲜重外,其余指标在品种间均有极显著差异(P<0.01)。根长、株高、根鲜重、根干重、茎叶鲜重、茎叶干重、叶绿素含量、POD活性、SOD活性、MDA含量的耐Cd指数变化范围分别为0.738～0.945,0.678～1.037,0.655～0.945,0.532～0.950,0.603～1.053,0.681～1.040,0.607～1.055,1.117～1.946,0.901～2.272,1.627～2.697。变异系数介于6.268%～27.044%之间,SOD活性耐Cd指数的CV最大,为27.044%,其次为根干重耐Cd指数,CV为20.455%,再次为MDA含量、POD活性和根鲜重的耐Cd指数,CV分别为17.304%,16.648%和16.612%,CV均大于15%,根长耐Cd指数的CV最小,为6.278%。

2.2.2甜高粱各指标的主成分分析 对26份甜高粱的根长、株高、根鲜重、根干重、茎叶鲜重、茎叶干重、叶绿素含量、POD活性、SOD活性和MDA含量10项指标的耐Cd指数进行主成分分析(表5),前3个主成分的贡献率分别为60.162%,16.334%,10.745%,累积贡献率达87.242%,因此提取3个主成分对耐Cd性进行分析,可代表10项原始指标的大部分数据信息。第1主成分的特征值为6.016,对应较高的特征向量为株高、根干重、叶绿素含量和MDA含量的耐Cd指数;第2主成分特征值为1.633,对应较高的特征向量为根鲜重、POD和SOD活性的耐Cd指数;第3主成分特征值为1.075,对应较高的特征向量为根长、茎叶鲜重和干重的耐Cd指数。

表4 不同Cd胁迫下相关指标的耐性指数X值Table 4 The X value of tolerance indicators of the tested varieties under cadmium stress

表5 各综合指标的系数、特征值、贡献率Table 5 Coefficient,characteristic value and contribution rate of each comprehensive index

2.2.3甜高粱苗期耐Cd性综合评价 由主成分分析结果,根据公式(1)计算出甜高粱各品种的3个综合指标得分值(表6),然后再根据公式(2)计算出不同品种各综合指标的隶属函数值Uij。在主成分1下,‘F10’(S8)的隶属函数值最大,U1值为1.000,表明‘F10’(S8)在第1主成分上耐Cd能力最强;而‘晋草12’(S13)的隶属函数值最小,U1值为0,表明‘晋草12’(S13)在第1主成分上耐Cd能力最差。

根据公式(3)计算各综合指标权重Wj,3个主成分的权重分别为0.690,0.187,0.123。带入公式(4)计算各甜高粱品种耐Cd能力综合评价值D值,并对其耐Cd能力强弱进行排序(表6)。其中‘辽甜6号’(S3)的D值最大,为0.952,表明其耐Cd能力最强,其次为‘F10’(S8)和‘10132’(S26),D值分别为0.881和0.872;‘晋草12’(S13)的D值最小,仅有0.116,说明其耐Cd能力最差。

采用欧氏距离法对D值进行聚类分析,可将26份甜高粱品种划分为3类：‘辽甜6号’(S3)、‘10132’(S26)和‘F10’(S8)为第Ⅰ类,共3个品种,耐Cd性排序位于前3位,D值为0.872～0.937,属于强耐Cd型品种;‘bmv6A×20152128’(S17)、‘皖甜1号’(S20)、‘大奖1180’(S6)、‘陇甜高1号’(S11)、‘10099’(S22)、‘Sx14A×海牧’(S14)、‘L407A×Ma-5-2’(S15)、‘10125’(S24)、‘辽甜3号’(S2)、‘青贮大师’(S18)、‘大力士’(S7)、‘10130’(S25)、‘陇甜高2号’(S12)、‘晋牧1号’(S16)、‘BJ0603’(S5)、‘皖草3号’(S21)、‘陇草2号’(S10)、‘陇草1号’(S9)、‘辽甜1号’(S1)、‘超级糖王’(S19)为第Ⅱ类,共20个品种,耐Cd性排序位于4～23位,D值为0.378～0.665,属于中等耐Cd型品种;‘辽甜7号’(S4)、‘晋草12’(S13)和‘10112’(S23)为第III类,共3个品种,耐Cd性排序位于24～26位,D值为0.114～0.136,属于Cd敏感型品种(表6)。

表6 各品种综合指标值、隶属函数值、权重、D值、排序及综合评价Table 6 Comprehensive index value,subordinate function value,index weight,D value,ranking and comprehensive evaluation of each tested variety

2.3 不同甜高粱品种的富集能力评价

2.3.1甜高粱对Cd的富集和转移能力差异 由表7可知,不同甜高粱品种对Cd的根部富集系数和茎叶富集系数差异极显著(P<0.01),范围分别为0.179～0.685和0.083～0.671;平均值分别为0.311和0.233;变异系数分别为44.095%和60.736%。供试26个甜高粱品种中,‘F10’(S8)、‘辽甜6号’(S3)和‘陇草2号’(S10)的根部富集系数最高,均大于0.5,分别是根部富集系数最小‘大力士’(S7)的3.8,3.3和2.9倍;‘辽甜6号’(S3)和‘F10’(S8)的茎叶富集系数最高,均大于0.5,是茎叶富集系数最小‘晋草12’(S13)的8.1和7.1倍。根部富集系数一般大于茎叶富集系数,除了‘辽甜6号’(S3)和10130(S25)外。

从表7可知,不同甜高粱品种对Cd的转移系数差异极显著(P<0.01),变化范围为0.338～1.137;平均值为0.734;变异系数CV为24.275%。‘10130’(S25)和‘辽甜6号’(S3)的转移系数最高,分别为1.137和1.126,分别是转移系数最小‘陇甜高2号’(S12)的3.4和3.3倍。

表7 各甜高粱幼苗中Cd生物富集系数及转移系数Table 7 Cd bioconcentration factor and transfer coefficient in sweet sorghum seedlings

2.3.2强Cd耐性、高富集转移能力甜高粱品种筛选 为筛选出对Cd耐性强、富集转移能力高的甜高粱品种,以甜高粱的耐Cd能力的综合评价值D值、地上部富集系数和转移系数为变量,采用欧氏距离法进行聚类分析,可将26种甜高粱品种划分为4类(图1)：第I类2个品种,包括‘辽甜6号’(S3)和‘F10’(S8),占供试材料的7.692%,属于耐性强且富集转移强型品种;第II类4个品种,包括‘10132’(S26)、‘陇草2号’(S10)、‘陇草1号’(S9)和‘辽甜1号’(S1),占供试材料的15.385%,属于耐性较强但富集转移较弱型品种;第III类数量最多共18个品种,包括‘10130’(S25)、‘陇甜高2号’(S12)、‘辽甜7号’(S4)、‘皖甜1号’(S20)、‘超级糖王’(S19)、‘青贮大师’(S18)、‘晋牧1号’(S16)、‘辽甜3号’(S2)、‘L407A×Ma-5-2’(S15)、‘BJ0603’(S5)、‘皖草3号’(S21)、‘大奖1180’(S6)、‘10125’(S24)、‘大力士’(S7)、‘陇甜高2号’(S12)、‘10099’(S22)、‘bmv6A×20152128’(S17)和‘陇甜高1号’(S11),占供试材料的69.231%,属于耐性较弱但富集转移较强型品种;第IV类2个品种,包括‘10112’(S23)和‘晋草12’(S13),占供试材料的7.692%,属于耐性弱且富集转移弱型品种。

图1 26个甜高粱品种的聚类分析Fig.1 Dendrogram of cluster analysis of 26 sweet sorghum varieties

3 讨论

3.1 Cd胁迫对甜高粱幼苗生长的影响

Cd对甜高粱幼苗有毒害作用,表现为叶片变窄变薄、叶片发黄失绿,植株变矮以及根系生长发育受阻,植株生长受到抑制,生长缓慢、生物量下降[18]。本研究中,Cd胁迫21 d,高粱呈根长变短、根重降低、株高变矮、茎叶重量降低、叶绿素含量下降、POD活性和MDA含量升高趋势。Cd进入植物体内,首先在根系积累,通过损伤根尖细胞的核仁,降低核糖核酸酶活性,改变RNA合成,抑制细胞分裂,阻碍根系的伸长生长[28],降低植物对营养物质的吸收[29]。然后经蒸腾作用由根系运输到地上部,进入叶绿体,影响叶绿素的生物合成和光化学反应的运行,扰乱叶绿体的功能,破坏光系统II(PSII),降低光合作用[30-31]。同时Cd诱导活性氧(ROS)的产生,造成细胞膜脂过氧化,破坏细胞内氧化还原平衡,损伤细胞内膜系统,影响植株的细胞代谢能力[32],最终阻碍植物正常的生长发育[20,33]。

3.2 甜高粱苗期耐Cd性评价

生长和生理生化指标均可用来评价植物的耐Cd性,单一指标分析耐Cd性时,虽然可对耐Cd性进行快速的鉴定,但植物的耐Cd性是多种生理生化的综合反应[34],受多因素调控,单项指标往往只能反映某个性状或某个时期对Cd胁迫的反应,难以全面的评价植物的耐Cd能力[35]。因此选择合适的方法是正确评价植物耐Cd能力的关键。前人对植物的耐Cd性已有相关研究,张付贵等[36]比较了单个指标和多指标对甘蓝型油菜幼苗期的耐Cd性进行评价,表明主成分分析法是耐Cd性评价的最优方法。田小霞等[26]运用基于主成分分析的隶属函数法筛选出6份强耐Cd能力的马蔺(Irislactea)材料。余玮等[37]利用隶属函数法评价9个苎麻品种的耐Cd性差异。本研究结果显示,除根鲜重外,其余9项指标的耐Cd指数在甜高粱品种间差异极显著。进一步表明用单项指标很难准确地反映出不同品种的耐Cd能力,选取多项指标综合评价值更可信,利用隶属函数法对多个指标进行综合分析,可以避免单一指标带来的片面性[38]。本研究中,主成分分析将10个单项指标转化成3个相互独立的综合指标,计算出各品种的3个综合指标值,再利用隶属函数法与各综合指标权重获得不同甜高粱品种苗期耐Cd能力的综合评价值D值,再根据D值进行聚类,将26个甜高粱品种划分成强耐Cd、中等耐Cd和Cd敏感3种类型。

3.3 甜高粱Cd富集和转移能力比较

植物通过根系吸收土壤中的Cd,并且储存在各个部位中,从而达到消减土壤Cd含量的目的。富集系数是评价植物吸附重金属能力的重要指标,富集系数越大,表明植物富集能力越强[39]。张英等[39]通过对269份苎麻资源进行评价鉴定,筛选出18份高Cd富集能力的种质。Tsuboi等[40]通过比较106个高粱品种Cd积累,最高基因型比最低高近140倍。籍贵苏等[17]研究表明Cd主要在高粱根中富集,本试验结果与之类似,大部分甜高粱品种的Cd富集系数表现为根部>茎叶,由于根最先直接接触Cd,植物为了使其他部位免遭毒害,在根中与Cd形成大分子络合物,影响Cd的转运[41],另外Cd与根部形成的植物螯合肽(PCs)能螯合钝化Cd2+,故而易在根部储存积累[42]。

植物吸收重金属后,根部还继续留在土壤中,其吸收的重金属又回到土壤中,只有地上部的重金属可彻底从土壤中移除,因此需要促进重金属从根部向上转移。转移系数是评价植物从根部向地上部转运重金属的能力,转移系数越大,植物转运重金属能力越强[41]。Jia等[15]认为96个高粱品种的Cd转移系数差异达4倍以上,且随Cd处理浓度增加,转移系数下降[16]。本试验中,不同甜高粱品种的转移系数为0.338～1.137,最大差异达到3.4倍。苯丙素和木质素合成、细胞壁修饰过程以及某些金属转运蛋白基因的差异表达可能是导致两个甜高粱品系对Cd吸收和转移能力不同的重要原因[16]。

此外,高粱对Cd的富集能力和转移能力不一致,如品种‘10130’(S25)、‘BJ0603’(S5)的根富集系数居中或偏低,但其转移系数却偏高;而‘晥甜1号’(S20)、‘10112’(S23)的根和茎叶富集系数均较高,但其转移系数却较低。可能是Cd在根中主要结合于细胞壁上或储存于液泡内,使细胞内游离的Cd少,移动性变差,前一器官对Cd具有固定或“拦截”能力,会对下一器官Cd的积累产生影响[43]。另外Cd的转移还与转运蛋白、重金属ATP酶4(HMA4)和植物镉抗性蛋白(PCR1/2)的差异有关[32]。因此,需要筛选富集和转移能力均较高的品种,从而提高植物修复效率。

3.4 综合评价

通常认为,植物重金属富集系数和转移系数均大于1,表明该植物富集能力强,适合用于重金属污染修复[44-46],但它忽略了植物富集能力与生长情况之间的关系,在实际应用中存在不足[47]。单一的耐性评价或富集能力评价具有局限性,存在富集能力强,但生物量低、生长缓慢,或者耐受性强,但富集转移重金属能力却低[48],导致修复周期长且去除污染量小[6]。本文中的‘辽甜7号’(S4)虽然对Cd敏感,但是Cd富集转移能力较强;而‘10132’(S26)耐Cd性强,但富集转移能力却较弱,均不适于修复重金属污染。因此,需要将二者结合起来,筛选出Cd耐受性强且富集、转移能力强的植物。胡旭等[49]采用水培试验,对181份海雀稗(Paspalumvaginatum)种质进行耐Cd性和Cd富集能力评价,筛选出6份可作为修复Cd污染土壤的种质。本研究以甜高粱的耐Cd能力的综合评价值D值、地上部富集系数和转移系数为变量,进行聚类分析,将26个甜品种划分为4种类型。其中‘10112’(S23)和‘晋草12’(S13)为Cd耐性弱且富集转移弱型品种,在生长上表现为植株矮小、叶片发黄,避免种植在Cd污染土壤上。‘辽甜6号’(S3)和‘F10’(S8)为Cd耐性强且富集转移强的品种,适合用于修复土壤Cd污染。

4 结论

通过主成分分析和隶属函数法,计算出不同甜高粱品种苗期耐Cd能力的综合评价值D值,再利用D值进行聚类,筛选出3份耐Cd性强的品种。采用欧氏距离法对D值、富集系数和转移系数进行聚类分析,将26个甜高粱品种划分成4类,耐性强且富集转移强型、耐性较强但富集转移较弱型、耐性较弱但富集转移较强型和耐性弱且富集转移弱型,其中‘辽甜6号’和‘F10’是耐性强且富集转移强型品种,具有较高的Cd吸收能力和转移能力,适用于修复土壤Cd污染。