重组人CC16蛋白改善慢性阻塞性肺疾病模型小鼠肺功能及其机制*

郭 民， 李 婷， 杨晓雪， 高 睿， 栗馨洋， 王海龙△， 庞 敏△

（1山西医科大学实验动物中心，山西 太原 030001；2山西医科大学第一医院呼吸与危重症医学科，呼吸疾病防治与基础研究山西省重点实验室，山西 太原 030001；3山西医科大学基础医学研究中心，山西 晋中030600）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，且随着发病率的升高其死亡率亦有所增加［1］。COPD 的特征是呼吸道持续性损伤，引起气道重塑，并伴有肺实质的破坏，进而导致呼气困难、气体潴留、肺通气过度和运动时呼吸短促，随着时间的推移，引起肺功能加速下降［2］。香烟烟雾（cigarette smoke， CS）诱发肺泡上皮细胞和内皮细胞衰老而参与COPD 的发生发展［3-4］，因此，降低COPD 患者肺部上皮细胞或内皮细胞衰老，将是改善COPD 患者肺功能的一种有益尝试。

CC16 （club cell secretory protein 16）是棒状细胞（club cells）分泌的具有肺组织特异性的蛋白质，具有抗炎、抗氧化和抗纤维化等生物学作用［5-6］。CC16基因缺失的小鼠更易罹患COPD［7］；与健康人相比，COPD 患者支气管肺泡灌洗液及血清中CC16也呈下降状态［8-9］，提示CC16 在COPD 的发生发展中具有重要作用。本课题组前期应用重组CC16 蛋白滴鼻COPD 模型小鼠，可显著降低小鼠气道炎症，减轻COPD 小鼠肺组织病理损伤［10］，然而重组CC16 蛋白对COPD 模型小鼠肺功能改善和肺组织细胞衰老的干预作用及机制还未阐明。因此，本研究拟应用重组人CC16 蛋白（recombinant human CC16， rhCC16）滴鼻干预COPD 模型小鼠，观察小鼠肺功能、肺组织病理损伤及肺组织细胞衰老状况，并对其机制进行初步研究。

材 料 和 方 法

1 实验动物

清洁级健康BALB/c 雄性小鼠（4~6 周龄）40 只，体重为20~22 g，购于山西医科大学实验动物中心［生产许可号：SCXK（晋）2019-0004，使用许可证号：SYXK（晋）2019-0007］。适应性饲养1 周后进行实验，相关实验动物操作获得山西医科大学实验动物伦理委员会批准。

2 试剂和仪器

rhCC16 由本实验室自主纯化［10］，用PBS 稀释至使用浓度进行实验。红塔山牌香烟（烟气烟碱量0.9 mg，焦油量10 mg，烟气CO 量11 mg）购自云南玉溪卷烟厂；逆转录试剂盒和实时荧光定量试剂盒购自北京聚合美生物科技有限公司；总RNA 提取试剂盒购自北京赛文创新生物科技有限公司；兔抗P16多克隆抗体和兔抗P21 多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗p-P38多克隆抗体和兔抗磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2， p-ERK1/2）多克隆抗体购自Cell Signaling Technology；免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

D30 微量核酸检测仪（Eppendorf）；Quant Studio 3 实时荧光定量PCR 仪（Thermo Fisher Scientific）；PFT 肺功能检测系统（上海塔旺智能科技）；JXFSTPRP 高通量快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）。

3 实验方法

3.1 实验分组 将40 只经过适应性饲养的小鼠随机均分为对照组、COPD 模型组、COPD+rhCC16 组、COPD+PBS 组，每组10 只。对照组作为空白对照不加任何干预，使其自由进食饮水；其余各组小鼠均采用被动吸烟法制备COPD 稳定期小鼠模型［11］，每日吸入烟雾1次，每次使用10支香烟，每周6 d，持续24周。COPD+rhCC16 组于熏烟16 周开始，在熏烟前2 h 给予小鼠双侧滴鼻rhCC16（2.5 µg/g），COPD+PBS组则使用等体积（20 µL）的PBS双侧滴鼻，每日1次，持续干预8周。

3.2 小鼠外观行为学观察及肺功能检测 实验期间每日观察各组小鼠被毛、精神状态及饮食情况等；小鼠肺功能检测：小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（35 mg/kg）进行深度麻醉，将小鼠固定于小鼠解剖台，暴露气管，使用配套软管从口腔插入气管，细线扎紧固定后，待小鼠无呼吸抵抗后上机检测，记录相应肺功能参数数值［0.3 秒内用力呼气容积（forced expiratory volume in 0.3 s， FEV0.3）、用力肺活量（forced vital capacity， FVC）、肺顺应性（dynamic compliance， Cdyn）及气道阻力（airway resistance， Raw）］。

3.3 小鼠肺组织形态学观察 肺功能检测完毕后，打开胸腔，暴露双肺，观察小鼠肺组织外观情况，将左肺置于4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，透明，石蜡包埋，切片，行常规HE 染色，高倍镜下随机选取5 个视野观察细胞，拍照并分析各组小鼠肺组织病理改变。

3.4 RNA 提取和RT-qPCR 将小鼠右肺取出，称取30 mg肺组织用高通量快速研磨仪进行研磨，得到肺组织匀浆后，吸取上清液，按照试剂说明书提取各组小鼠肺组织总RNA。按试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA；qPCR 反应体系为10 ng cDNA、2× M5PCR预混液10 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各0.5 µL，ddH2O 补足至20 µL。qPCR 反应程序为：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 个循环；95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。采用2-ΔΔCt计算各基因mRNA 的相对表达水平，并对结果进行统计学分析。引物由北京中美泰和科技有限公司合成。P16 上游引物序列为5'-GCTGGGTGGTCTTTGTGTA-3'，下游引 物 序列为5'-TGCCATTCCTTTCCTGTC-3'；P21 上游引物序列为5'-AGTGTGCCGTTGTCTCTTC-3'，下游引物序列为5'-AGTCAAAGTTCCACCGTTCT-3'；GAPDH 上游引物序列为5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物序列为5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。

3.5 免疫组织化学 肺组织切片脱蜡至水，梯度酒精进行水化（酒精浓度从低到高），3% H2O2孵育30 min，微波炉内抗原修复，待液体冷却至室温后PBS洗3 次，滴加5% BSA 封闭后，分别与P16 抗体（1∶100）、P21 抗体（1∶100）、p-P38 抗体（1∶100）和p-ERK1/2 抗体（1∶100）于4℃孵育过夜，次日PBS 洗涤3次，滴加二抗，PBS洗涤3次，DAB工作液显色，于显微镜下观察显色情况，流水冲洗，苏木素复染，流水冲洗，1%盐酸酒精分化10 s，流水冲洗反蓝，脱水，树脂封片，显微镜下观察染色情况并采集图像，使用ImageJ 软件分析免疫组化阳性染色面积占总细胞面积百分率。

4 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.00 统计软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。两组之间采用独立样本t检验进行比较，三组及三组以上的组间比较采用单因素方差分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

结 果

1 rhCC16改善COPD小鼠被毛及行为

对照组小鼠被毛有光泽，活泼好动，精神状态良好，呼吸平缓均匀，无打斗现象；模型组小鼠毛发稀疏暗黄且无光泽，部分小鼠出现脱毛现象，熏烟时喜扎堆蜷缩于角落，精神状态不佳，烦躁不安，易出汗，呼吸急促，伴有张口呼吸，饲养过程中常有打斗现象发生。rhCC16 干预组小鼠被毛未显著改善，打斗减少，亦喜欢扎推，但呼吸趋于平缓均匀；PBS 组小鼠被毛及行为与模型组相同。

2 rhCC16有效改善COPD小鼠肺功能

与对照组相比，COPD 小鼠FEV0.3/FVC 比值降低（P<0.05），气道阻力增加（P<0.05），肺顺应性降低（P<0.05）；与COPD 模型组相比，rhCC16干预组小鼠FEV0.3/FVC 比值和肺顺应性均升高（P<0.05），而气道阻力降低（P<0.05），而PBS 组小鼠各项指标与COPD组相比均无显著差异（P>0.05），见图1。

Figure 1.Detection of the lung function in different groups.A： forced expiratory volume in 0.3 s （FEV0.3）/forced vital capacity（FVC）； B： airway resistance （Raw）； C： lung dynamic compliance （Cdyn）.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group；#P<0.05， ##P<0.01 vs COPD group.图1 各组小鼠肺功能检测

3 rhCC16可减轻COPD小鼠肺部损伤

对照组小鼠肺组织呈正常的淡粉红色，表面光滑；COPD 组小鼠肺组织因长时间吸入香烟烟雾而呈暗红色，并且肺表面可见充血灶，有深红色瘀斑（白色箭头所示）；与COPD 组相比，rhCC16 组小鼠肺组织颜色有所恢复，充血灶、红色瘀斑减少；但PBS 组小鼠肺组织与COPD 组形态和颜色相似（图2A）。HE 染色显示，对照组小鼠肺泡大小均匀，结构清晰，气道粘膜上皮结构完整；COPD 组小鼠气道壁破裂塌陷，肺泡大小不均匀，多呈不规则扩大，形成肺大泡，管腔狭窄，管壁增厚，炎症细胞浸润；rhCC16 组小鼠肺泡结构有所恢复，肺大泡减少，炎症细胞减少；PBS组小鼠肺组织与COPD组形态相似（图2B）。

Figure 2.Morphological and pathological changes of the lung tissues in various groups of mice.A： morphological changes of the lungs in mice （congestive lesions and ecchymosis were observed on the surface of lung tissues in COPD mice， while rhCC16 treatment alleviated the aforementioned pathological injuries）； B： HE staining of mice lung tissues （scale bar=200µm； the airway wall of COPD mice ruptured and collapsed， accompanied by the formation large alveoli and infiltration of inflammatory cells， while rhCC16 treatment mitigated the aforementioned pathological injuries； white arrow indicates red ecchymosis， red arrow indicates inflammatory cells， and green arrow indicates rupture and collapse of the airway wall）.图2 各组小鼠肺组织形态及病理学改变

4 rhCC16可抑制COPD小鼠肺组织细胞衰老

RT-qPCR 结果显示，与对照组相比，COPD 小鼠肺组织P16 和P21 的mRNA 表达水平均有显著升高（P<0.05），rhCC16 干 预 可 显 著 降 低P16 和P21 mRNA 表达（P<0.05），而二者在PBS组与COPD组小鼠间无显著差异（P>0.05），见图3。

Figure 3.The mRNA expression of P16 （A） and P21 （B） in mouse lung tissues of various groups detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs COPD model group.图3 RT-qPCR检测各组小鼠肺组织P16和P21的mRNA水平

免疫组织化学染色结果显示，与对照组相比，COPD 小鼠肺组织P16、P21 和衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase， SA-β-Gal）表达显著升高（P<0.05），rhCC16 干预可显著降低P16、P21 和SA-β-Gal 表达（P<0.05），而三者在PBS组与COPD组小鼠间无显著差异（P>0.05），见图4。

Figure 4.Immunohistochemical staining of senescence-associated β-galactosidase （SA-β-Gal）， P16 and P21 in mouse lung tissues of various groups（scale bar=200 µm）.Senescence markers such as SA-β-Gal， P16 and P21 in lung tissues of COPD mice were increased， while rhCC16 treatment significantly reduced their levels.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs COPD group.图4 各组小鼠肺组织P16、P21及SA-β-Gal表达的免疫组化检测

5 rhCC16 抑制COPD 小鼠肺组织细胞中的P38 MAPK/ERK1/2信号通路

免疫组织化学染色显示，与对照组相比，COPD小鼠肺组织细胞p-P38 和p-ERK1/2 染色阳性率显著增加（P<0.05），rhCC16 干预可显著降低p-P38 和p-ERK1/2 表达（P<0.05），而二者在PBS 组与COPD 组小鼠间无显著差异（P>0.05），见图5。

Figure 5.The levels of p-P38 and p-ERK1/2 in mouse lung tissues of various groups detected by immunohistochemical staining （scale bar=200 µm）.The levels of p-P38 and p-ERK1/2 in lung tissues of COPD mice were elevated， while rhCC16 treatment significantly decreased their levels.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs COPD group.图5 免疫组织化学染色检测各组小鼠肺组织细胞p-P38和p-ERK1/2水平

讨 论

COPD 以炎症和肺组织结构变化导致的气流持续受限为主要特征，是一种无法治愈的慢性肺病，包括慢性支气管炎、肺气肿和小气道阻塞，在某些个体中还伴有肺心病和呼吸衰竭，给患者和社会都带来了巨大负担，而吸烟被认为是引发COPD 的主要环境因素。炎症、氧化应激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及细胞衰老被认为是COPD 的发生发展的主要机制［12，13］。截至目前，COPD 仍然没有特异性治疗方法，改善气流受限的治疗方案仍然是主要途径。在COPD 急性发作期，抗生素、吸入性皮质类固醇、支气管扩张剂在临床上被广泛应用，但此类药物的副作用亦不容忽视。

CC16 是一种分子量约为10 kD 的同型二聚体蛋白质，由非纤毛细支气管上皮细胞在远端气道中分泌，具有肺组织特异性［14］。体内外研究表明，CC16具有抗炎、免疫调节和抗氧化作用［15］。临床研究报告指出，COPD 患者及肺功能缺陷患者的血液和气道中CC16 水平降低［16］。此外，低血清CC16 水平加重肺上皮细胞损伤，减弱1 秒内用力呼气量（FEV1）［17-18］。课题组前期研究显示，重组大鼠CC16蛋白质通过抑制核因子κB 降低炎症因子表达进而改善COPD 模型小鼠肺部炎症及病理损伤［11］，且可以降低脂多糖诱导的大鼠气道上皮细胞炎症因子表达［19］。而其对延缓细胞衰老，改善COPD 小鼠肺功能方面的研究还未见报道。

目前，构建COPD 模型小鼠的经典方法是通过香烟烟雾诱导，此方法可以诱导出许多COPD 典型病理特征，例如气道阻力增加、肺顺应性降低、肺活量下降、肺通气受限等［20］。在COPD 模型小鼠研究中，FEV0.3、FVC 及FEV0.3/FVC 是常用的评价小鼠肺功能的指标［21］。本研究中，COPD 模型小鼠经6 月被动吸烟被成功制备，与正常对照组小鼠相比，FEV0.3/FVC 比值降低，气道阻力升高并且肺顺应性降低，而rhCC16 干预组小鼠的各项指标均得到改善，表明rhCC16能够有效缓解香烟烟雾刺激引起的肺功能下降。Laucho-Contreras 等［22］的研究显示，CC16基因缺失小鼠的肺组织在发育中自发地向肺老化表型转化，并伴有COPD样肺部病变，表明CC16对小鼠肺组织结构和功能的影响可能通过衰老途径。而我们的研究显示给予rhCC16干预可以降低COPD 小鼠肺组织衰老标志物β-半乳糖苷酶、P16 和P21 的表达，提示rhCC16 可通过抑制细胞衰老进而发挥改善COPD小鼠肺功能的作用，进一步明确了CC16-细胞衰老在COPD 发生发展中的作用，为认识COPD 的发生机制提供实验证据。

COPD 主要由香烟烟雾、空气过敏原、空气污染物和细菌感染诱发，而在呼吸道内，这些环境因子都能够激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPKs）家族［23］。MAPKs 包含三种主要信号分子即ERK1/2、c-Jun 氨基末端激酶和P38 MAPK。MAPKs 通过磷酸化调节与衰老相关蛋白质的活性来控制细胞反应程序。P38 MAPK 和ERK1/2的激活（磷酸化）可以促进多种因素诱导的细胞衰老［24-25］，且二者的激活 也 参与了COPD 的发生发展［20，26-27］。鉴此，我们检测了各组小鼠肺组织p-P38 MAPK 和p-ERK1/2 的表达，结果显示rhCC16 可以有效降低COPD小鼠肺组织p-P38和p-ERK1/2的含量，提示rhCC16 可能通过抑制P38 MAPK 和ERK1/2 信号级联通路延缓香烟烟雾诱导的细胞衰老。我们前期研究显示CC16 可以抑制核因子κB 活性，降低炎症因子表达，减轻小鼠COPD 症状［11］。本项工作则从MAPK-细胞衰老通路观察了CC16 在COPD 模型小鼠肺组织的表达，显示出CC16 在COPD 模型小鼠中通过多条信号通路发挥多种生物学效应。

综上所述，rhCC16 可能通过抑制P38 MAPK 和ERK1/2信号级联通路延缓香烟烟雾诱导的COPD 小鼠肺组织细胞衰老，改善COPD小鼠肺功能。