基于PI3K/AKT/mTOR 信号通路探讨野黄芩苷联合虎杖苷抗慢性支气管炎的作用机制*

王 祁， 赵 博， 高 璐， 李敏仪， 李 瑶， 张萌萌，卫培峰，2， 王 斌， 李 敏△

（1陕西中医药大学，陕西 西安 712046；2陕西中医药大学第二附属医院，陕西 西安 712099）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease， COPD）是不可逆气流阻塞和有害环境刺激的持续炎症［1］，是全球第三大致病率和致死率的主要因素。COPD 包括一些列疾病，慢性支气管炎（chronic bronchitis， CB）和肺气肿是其中典型，大多数病人同时患有这两种疾病的某些特征。流行病学研究对CB 没有固定定义，但普遍定义为连续2 年每年有至少3 个月的慢性咳嗽和痰液产生［2］。CB 临床表现为肺功能极速下降、易引发下呼吸道感染。目前，导致CB 的发病机制尚不完全清楚，但主要涉及气道黏液细胞化生、炎症反应和肺气肿等［3］。

CB 的临床治疗是联合使用抗生素，而抗生素长期服用会产生耐药性，同时有较多不良反应［4-5］。中医药在CB 和COPD 的治疗历史悠久、优势独特。CB属中医学“咳嗽”“喘证”“痰证”“饮证”等范畴，分痰湿蕴肺、痰热郁肺、肝火犯肺和肺阴不足四种证型［6］。结合现代医学对CB 的认识，临床治疗以清热化痰、宣肺止咳平喘为主。周兆山教授［7］运用黄芩-虎杖（Huzhang， HZ）配伍治疗COPD 具有显著疗效。课题组前期研究了黄芩茎叶（Huangqin Jingye，HQJY）的抗炎活性，证实HQJY 在肺系感染性疾病中具有重要作用，同时配伍HZ 可增强清热、泻肺和化痰止咳之力。因此本研究以HQJY和HZ的标志性成分野黄芩苷（scutellarin， Scu）和虎杖苷（polydatin，PD）作为研究对象，探究其抗大鼠CB 的药效及作用机制，同时设置了桂龙咳喘宁片（Guilong Kechuanning tablet， GLKCN）作为阳性对照，验证Scu联合PD的疗效，为后续研究呼吸系统疾病提供用药参考资料。

材 料 和 方 法

1 实验材料

1.1 药物 HQJY-HZ 饮片购自亳州京晥中药饮片厂；Scu 和PD 购自北京索莱宝科技有限公司（纯度≥98%）；GLKCN 购自江西药都仁和制药有限公司；称取干燥HQJY 和HZ饮片各50 g，混匀后加入1 L水浸泡30 min，武火煮沸后改文火煎煮50 min，过滤，再加入800 mL蒸馏水同法煎煮40 min，合并两次滤液，旋转蒸发仪70 ℃浓缩至200 mL，过滤，制成含生药量0.5 g/mL的浓缩液。

1.2 动物 90 只SPF 级SD 雄性健康大鼠，6~8 周龄，体质量（200±20） g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2020-030。动物伦理批准号：SUCMDL-2022041201。

1.3 试剂 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）购自Sigma；白细胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）、IL-6、IL-17A、IL-10 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和丙二醛（malondialdehyde， MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B， PKB/AKT）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）抗体购自武汉博士德生物科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒、RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自上海威奥生物科技有限公司。

1.4 仪器 全波长酶标仪（Thermo Fisher）；小型垂直电泳槽（Bio-Rad）；荧光定量PCR 仪（Roche）；转膜仪（BioTek）。

2 实验方法

2.1 动物分组、造模及给药 适应性喂养1 周后，将大鼠随机分为对照组、模型组、HQJY-HZ 水煎液（5 g/kg）组［8］、Scu （40 mg/kg）组［9］、PD （60 mg/kg）组［10］、高 剂 量（80 mg/kg+120 mg/kg） Scu+PD （Scu+PD-H）组、中 剂 量（40 mg/kg+60 mg/kg） Scu+PD（Scu+PD-M）组、低剂量（20 mg/kg+30 mg/kg） Scu+PD （Scu+PD-L）组和GLKCN （1 g/kg）组，每组10 只。于第1 天和第30 天用乙醚麻醉大鼠，采用气管滴注法［11］构建大鼠CB 模型。具体操作如下：插入进样针至气管入口1 cm 处，缓慢推注1 mL/kg 的LPS 溶液（1.5 mg/kg），轻摇，使LPS 均匀分布在大鼠两肺；第2~60 天（第30 天除外），将大鼠置于120 cm×60 cm×50 cm 的自制烟熏箱中30 min，每次10 根香烟，每天2 次，每次烟熏间隔6 h，建立CB 模型。从造模第47天起灌胃给药，药物组给予相应剂量的药物，对照和模型组灌胃等体积（10 mL/kg）生理盐水。

2.2 动物处理 在末次给药次日，采用10%水合氯醛麻醉大鼠后腹主动脉取血，静置30 min，1 509×g离心15 min得到血清，-80 ℃保存备用。采血后剪开颈部和胸腔，暴露气管和肺组织，进行支气管肺泡灌洗，合并两次支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF），1 048×g离心10 min 后分离上清液和沉淀物待测。灌洗完后，取大鼠右肺组织计算湿/干（wet/dry， W/D）质量比值；收集肺组织和支气管于4%多聚甲醛中固定，用于肺组织和支气管病理损伤观察和组织评分；剩余肺组织封装存于-80 ℃检测相关mRNA和蛋白表达。

2.3 大鼠右肺组织W/D 质量比值测定 将右肺组织处理后分别置于分析天平上精确称量湿质量和干质量，计算质量比，判断肺组织水肿程度。

2.4 大鼠BALF中蛋白含量测定及白细胞和中性粒细胞计数 取BALF 上清液0.5 mL，按照BCA 蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白含量，取BALF沉淀物用生理盐水稀释至3 mL，168×g离心10 min 后吸取细胞悬液固定，干燥后瑞氏染色于显微镜下进行白细胞计数和中性粒细胞计数。

2.5 组织病理学观察及评分 将每组于4%的多聚甲醛固定的样品脱水后制备石蜡标本，切片后HE染色，在光镜下观察支气管和肺组织损伤程度。在双盲情况下采用Smith 评分方法［12］，观察指标包括：（1）肺泡充血程度；（2）出血；（3）肺间质中性粒细胞浸润；（4）肺泡胞壁程度［13］。按评分指标对每张切片进行观察及评分。

2.6 支气管和血清炎症因子测定 参照ELISA 试剂盒说明书操作步骤，测定大鼠支气管和血清中IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-10和TNF-α炎症因子含量。

2.7 SOD 活性和MDA 含量测定 按照试剂盒说明书检测肺组织中SOD活性和MDA含量。

2.8 RT-qPCR 检测肺组织中PI3K、AKT 和mTOR 的mRNA 表达 用Trizol 提取大鼠肺组织总RNA，进行反转录，以β-actin为内参照，检测PI3K、AKT和mTOR的mRNA 表达。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。PI3K 的上游引物序列为5'-AAGCAGGCAGCCGAGTATC-3'，下游引物序列为5'-TTTCGTTTCCCACCATTC-3'，扩增产物长度为89 bp；AKT的上游引物序列为5'-CTACGGTGCGGAGATTGTG-3'，下游引物序列为5'-AGAACGTCTTCATGGTGGC-3'，扩增产物长度为95 bp；mTOR 的上游引物序列为5'-GAGATACGCCGTCATTCCT-3'，下游引物序列为5'-GCTCAAACACCTCCACCTT-3'，扩增产物长度为97 bp；β-actin的上游引物序列为5'-TGTCACCAACTGGGACGATA-3'，下游引物序列为5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3'，扩增产物长度为165 bp。反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，45 个循环。扩增完后分析熔解曲线，采用2-ΔΔCt法计算各mRNA相对表达。

2.9 Western blot 检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR 和p-mTOR 蛋白水平 用RIPA 裂解缓冲液提取蛋白并按照BCA 蛋白定量试剂盒说明书测定浓度，随后将蛋白上样、转模、封闭，分别加入Ⅰ抗，于4 ℃下过夜；第2 天TBST 清洗后再加入Ⅱ抗，孵育、洗膜、显影、扫描，使用ImageJ软件计算条带灰度值。

3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件包进行统计学处理，应用GraphPad Prism 7 软件作图。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。用单因素方差分析进行组间检验，LSD 法进行检验后多重比较。P<0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠右肺W/D质量比值的变化

与对照组比较，模型组大鼠右肺W/D 质量比值显著升高（P<0.01）；与模型组比较，GLKCN、HQJYHZ、Scu、PD 和Scu+PD 组大鼠右肺W/D 质量比值均显著降低（P<0.05或P<0.01），见图1。

Figure 1.Wet/dry （W/D） mass ratio of the right lung of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； *P<0.05， **P<0.01 vs model group.图1 各组大鼠右肺湿/干质量比值

2 大鼠BALF 中蛋白含量、白细胞数量和中性粒细胞数量的变化

与对照组相比，模型组大鼠BALF 中蛋白含量、白细胞数量和中性粒细胞数量均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 组大鼠BALF 中蛋白含量、白细胞数量和中性粒细胞数量均显著降低（P<0.05 或P<0.01）， 见表1。

表1 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中蛋白含量、白细胞和中性粒细胞数Table 1.Protein content， leukocyte count and neutrophil count in bronchoalveolar lavage fluid of the rats in each group（Mean±SD.n=10）

3 大鼠组织病理学观察及评分

对照组大鼠肺组织结构完整，细胞核大小均匀，肺泡腔清晰可见，无炎症细胞浸出和肺泡壁增厚等病理学改变；模型组大鼠肺泡组织破坏，有红细胞渗出，细胞核变形，可见大量中性粒细胞，肺泡壁明显增厚，肺泡间质有水肿、增生；与模型组比较，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 组的炎症细胞浸出明显减少，肺间质水肿明显减轻，见图2。

对照组大鼠支气管上皮细胞排列整齐、支气管管腔清晰、无杯状细胞增生现象，支气管通畅无阻塞；模型组大鼠支气管上皮细胞排列错乱，出现杯状细胞增生现象，支气管周边有较多炎症介质浸润，管腔有阻塞现象；GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 组大鼠支气管管周炎症细胞浸润和环节细胞增生现象均有不同程度减轻，见图3。

Figure 3.Pathological changes of rat bronchi in each group （HE staining， scale bar=20 µm）.图3 各组大鼠支气管病理变化

4 大鼠BALF中IL-1β和IL-6含量的变化

与对照组比较，模型组大鼠BALF 中IL-1β 和IL-6 水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 组大鼠BALF 中IL-1β和IL-6水平均显著降低（P<0.01），见图4。

Figure 4.The levels of IL-1β （A） and IL-6 （B） in bronchoalveolar lavage fluid of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.图4 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-1β和IL-6水平

5 大鼠血清IL-17A、TNF-α和IL-10水平的变化

与对照组比较，模型组大鼠血清中IL-17A 和TNF-α 水平显著升高（P<0.01），IL-10 水平显著降低（P<0.01）；与模型组比较，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 组大鼠血清中IL-17A 和TNF-α 水平均显著降低（P<0.05 或P<0.01），IL-10 水平显著升高（P<0.01），见图5。

Figure 5.The levels of IL-17A （A）， TNF-α （B） and IL-10 （C） in serum of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； *P<0.05， **P<0.01 vs model group.图5 各组大鼠血清中IL-17A、TNF-α和IL-10水平

6 大鼠肺组织匀浆中MDA和SOD含量的变化

与对照组比较，模型组大鼠肺组织匀浆中MDA含量显著增多（P<0.01），SOD 活性显著降低（P<0.01）；与模型组比较，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 组大鼠肺组织匀浆中MDA 含量均显著减少（P<0.01），SOD活性显著升高（P<0.01），见图6。

Figure 6.The MDA content （A） and SOD activity（B） in lung tissue homogenate of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.图6 各组大鼠肺组织匀浆中MDA含量和SOD活性

7 大鼠肺组织中PI3K/AKT/mTOR 的mRNA表达

与对照组比较，模型组大鼠肺组织中PI3K、AKT和mTOR 的mRNA 表达水平均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 组大鼠肺组织中PI3K、AKT 和mTOR 的mRNA 表达水平均显著降低（P<0.01），见图7。

Figure 7.The mRNA expression of PI3K （A）， AKT （B） and mTOR （C） in lung tissues of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.图7 各组大鼠肺组织中PI3K、AKT和mTOR的mRNA表达

8 大鼠肺组织中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平

与对照组比较，模型组大鼠大鼠肺组织中p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR 蛋白水平均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，GLKCN、HQJY-HZ、Scu、PD 和Scu+PD 组大鼠肺组织中p-PI3K、p-AKT 和p-mTOR蛋白水平均显著降低（P<0.01），其中Scu+PD-H组抑制PI3K、AKT 和mTOR 蛋白磷酸化的作用最为显著（P<0.01），见图8。

Figure 8.The protein levels of PI3K， p-PI3K， AKT， p-AKT， mTOR and p-mTOR in lung tissues of the rats in each group.Mean±SD.n=10.##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.图8 各组大鼠肺组织中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR蛋白水平

讨 论

CB 是全球范围内常见的慢性呼吸系统疾病，是导致死亡和残疾的主要原因之一［14］。CB 的特征是气管和支气管黏膜慢性炎症和痉挛，导致呼吸困难、咳嗽、痰液产生等症状［15］。CB 属中医咳嗽、喘证范畴［16］。在LPS 诱导的CB 模型中，HQJY 配伍HZ 可治肺热咳嗽、气喘痰多。经查阅相关资料，本研究采用HQJY 和HZ 中含量最高的有效成分Scu 和PD 进行后续大鼠实验。

多种病理生理过程都有炎症的存在，炎症有助于机体抵御外来微生物的侵袭，但过度炎症应激反应会加重机体的负担。本研究通过免疫细胞计数来评估炎症反应的严重程度［17］，结果提示CB 模型大鼠BALF 中白细胞和中性粒细胞升高，炎症反应被激活，经药物干预后支气管损伤减轻，炎症水平降低，提示Scu 和PD 有抗炎效果，与既往研究相符。有研究表明Scu 和PD 可通过抑制IL-1β、IL-6、IL-17A 及TNF-α 的表达，同时促进IL-10 的表达，来减轻呼吸道炎症而发挥肺保护作用［18-19］。因此，针对这些炎症因子的调控是CB治疗的一个潜在方向。

CB 常常会引起氧化应激，即机体内氧自由基产生过多，而抗氧化能力相对下降［20］。本研究显示在大鼠肺组织内SOD活性和MDA含量在LPS滴注加烟熏后均显著增加，而肺病理损伤状态与氧自由基含量有关，在肺组织中SOD变化和MDA变化趋势相悖，说明该疾病形成过程中不断在消耗SOD 产生大量氧自由基，引起肺组织细胞脂质过氧化，导致肺组织大面积损伤；给药后氧化应激损伤均不同程度减轻。

PI3K/AKT/mTOR 信号通路是一条重要的炎症通路，在炎症反应、细胞增殖凋亡等方面发挥着重要作用［21］。PI3K作为细胞膜上的酶通过磷酸化作用将磷脂酰肌醇转化为磷脂酰肌醇三磷酸，从而激活下游的AKT 和mTOR 等信号分子［22］。炎症因子通过细胞膜上的受体激活PI3K，继而与AKT 的N 端PH 结构域结合促进AKT 的磷酸化，促进细胞增殖、生长、代谢等生理过程［23］。mTOR 是AKT 的下游信号分子，可促进蛋白质合成及细胞生长等过程［24］。研究表明，炎症细胞可以通过激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路来调控多种炎症因子，促进细胞增殖、分化和凋亡抑制，导致炎症反应加剧［25-26］。此外，当组织受到氧化应激、损伤等刺激时，也会激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，引发炎症反应和组织损伤，加剧CB 的发展［27］。本研究结果显示，各种药物均通过降低CB 大鼠肺组织中PI3K/AKT/mTOR 通路的活化，进而抑制炎症反应，阻断CB进一步发展。

综上所述，Scu 联合PD 可抑制CB 大鼠的炎症反应，其抗炎作用与抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路活化，减轻氧化应激反应，抑制炎症因子IL-17A、TNFα、IL-1β和IL-6有关。然而，单独提高Scu或PD的剂量，且在无毒副作用的范围内，是否可以达到Scu 和PD联用的效果，尚待研究。