自体骨髓浓缩物和富血小板血浆治疗膝关节软骨损伤

冯玉娇,周田华,李明军,陈志安,吕晓雨,王刚,徐永清,谭洪波*

(1.昆明医科大学,云南 昆明 650000;2.中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院骨科,云南 昆明 650000)

膝关节作为人体的主要承重关节,软骨损伤很常见。软骨组织因缺乏血管、软骨细胞增殖迁移能力差、细胞外基质复杂等原因[1-2],导致其愈合潜力有限。患者膝关节软骨损伤后,关节内微环境随之改变,多种炎症因子继发性产生,若同时关节腔内存在滑膜增厚、滑膜炎症、游离体等情况,关节腔内微环境会继续恶化,进一步影响关节软骨损伤的修复过程[3]。通过关节镜清理术(arthroscopic debridement,AD)去除不稳定或分层的软骨瓣、游离体等不利因素,可缓解疼痛并解除机械卡压症状,创造更利于软骨修复的环境[4-5]。但大量研究表明,软骨损伤后采用单纯AD疗效欠佳[3]。AD联合生物制剂、生物材料或化学药物等治疗更有利于软骨修复[6],其中生物制剂因自身携带各类可修复软骨的细胞成分及生长因子等而倍受关注。目前临床应用较多的生物制剂有富血小板血浆(platele rich plasma,PRP)、骨髓浓缩物(bone marrow aspirate concentrate,BMAC)、间充质干细胞、肉毒杆菌毒素、皮质类固醇、透明质酸等[2]。其中BMAC和PRP相较于其他生物制剂制取方便且为患者自身组织,患者接受度较高;同时一般认为BMAC或PRP可以促进软骨修复[7-8]。有研究表明BMAC或PRP治疗可通过改善关节腔内炎性环境、释放促进软骨愈合的各类生长因子等途径促进软骨修复,部分患者症状及功能改善甚至可持续到术后12个月[9]。但同时有少数研究认为PRP注射对软骨损伤不能起到修复作用[10],甚至加重膝关节肿胀、疼痛[11],这可能与具体的制取、使用方式及评价指标有关。目前AD联合PRP或BMAC的报道较少,两者疗效差异及具体影响尚不明确。本研究纳入2020年7月到2021年8月中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院应用AD治疗的62例膝关节软骨损伤患者资料,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入标准:(1)年龄18～65岁;(2)身体质量指数(body mass index,BMI)为18～30 kg/m2;(3)经影像学检查证实为膝关节软骨损伤,膝关节软骨损伤<2 cm2,国际软骨修复学会(international cartilage repair society,ICRS)分级Ⅰ～Ⅱ级,软骨下骨无损伤;(4)关节内存在滑膜增生、滑膜炎、游离体等需进行关节清理术的情况;(5)下肢无明显X型腿或O型腿;(6)近1年膝关节局部未进行过其他药物注射治疗。排除标准:(1)骨质疏松明显;(2)骨骼未成熟者;(3)力线不良者;(4)存在半月板损伤、交叉韧带和侧副韧带断裂或三者术后未痊愈者;(5)膝关节严重积液;(6)使用皮质类固醇和免疫抑制剂;(7)一般健康状况不佳,酗酒或滥用药物;(8)既往接受过自体血液制品或干细胞制剂治疗。本研究获得了本院伦理委员会批准[伦审2020-021(科)-01],并在中国临床实验中心完成注册(ChiCTR2100054792);受试者均知情同意,并签署知情同意书。

本研究共纳入62例单侧膝关节软骨损伤患者,其中男29例,女33例;年龄18～65岁,平均(32.57±8.58)岁;平均BMI(23.02±1.26)kg/m2。患者术前MRI显示膝关节软骨有损伤迹象,且关节内有不同程度滑膜增生、游离体存在等情况,ICRS I级30例,Ⅱ级32例。患者既往慢性病为高血压、糖尿病、冠心病等,接受治疗时慢性病病情控制平稳。根据随机数字分类法将患者分为三组,AD+BMAC组(AD联合BMAC注射)22例,AD+PRP组(AD联合PRP注射)18例,AD组(单纯AD治疗)22例。三组患者一般资料差异无统计学意义(P>0.05,见表1),具有可比性。

表1 患者一般资料比较

1.2 材料制备

1.2.1 BMAC制备 (1)患者取侧卧位,髂后上棘定位后,洗手、消毒、带手套,铺洞巾。确定穿刺点位置,以2%利多卡因行皮肤、皮下组织和骨膜麻醉。(2)骨穿针髂后上棘穿刺,进针3～5 cm,进入穿刺位置后,连接装有1 mL肝素钠抗凝液的10 mL注射器[12-13]。(3)抽取骨髓同时晃动注射器,使骨髓液跟注射器内的肝素钠充分混合;同时旋转调整骨穿针头端开口位置,避免骨髓液稀释。(4)采集的骨髓液18 mL+2 mL肝素钠钠抗凝液共20 mL放入离心管内,以1 000 g离心力离心10 min。(5)离心后可见骨髓分为3层,上层为淡黄色浆液层,中间为黄褐色有核细胞层,下层为深红色细胞层。(6)5 mL注射器空针插入试管盖下进行排气,避免提取过程中负压形成空气涡流影响分层。(7)20 mL注射器连接吸血针插入液面下1 mL处吸取上层浆液层,注意离心管应始终保持垂直直立状态以保持分层清晰存在,液面下降时针头应随之下降。(8)抽取至浆液层剩余2 mL,然后充分摇晃离心管,将有核细胞层充分混入剩余浆液层内。抽取出此混合物即可得到最终BMAC(见图1)。BMAC在制备后10 min内完成注射。

a 髂后上棘穿刺抽取骨髓 b 骨髓离心后分为3层 c 制备好的BMAC图1 BMAC制备过程

1.2.2 PRP制备 (1)评估患者上肢静脉血管情况后,扎止血带、消毒铺巾,采血针采血。(2)应用离心管收集血液,同时晃动离心管,使血液与管内的枸橼酸钠充分混合。(3)每例患者采集18 mL静脉血放入离心管内,以1 500 g离心力单次离心10 min。(4)离心结束后,血浆和血细胞已分层。(5)5 mL注射器空针插入试管盖下进行排气。(6)20 mL注射器连接吸血针插入液面下1 mL处吸取上层血浆,液面下降时针头应随之下降。(7)抽取至血浆剩余2 mL,然后充分摇晃离心管,将有血小板层充分混入剩余血液层内。抽取出此混合物即可得到最终PRP(见图2)。PRP在制备后10 min内完成注射。

a 离心后血浆和血细胞分层 b 制备好的PRP图2 PRP制备过程

1.3 手术方法 检査术前影像确认患肢,患者仰卧位,麻醉成功后消毒、铺巾。患膝屈曲,膝关节镜进行全面检查,确定软骨损伤位置及损伤情况。刨削病变滑膜,清理游离体,磨削增生的骨赘;清除膝关节内受损的软骨、硬化骨质等,直至暴露出正常软骨,使软骨缺损区周围正常软骨边缘垂直于缺损平面;彻底清理膝关节内碎屑、多余滑膜等;充分止血,充分清洗后尽量吸除关节内液体。AD+BMAC组将制备好的2 mL BMAC注入关节腔内,AD+PRP组将制备好的2 mL PRP注入关节腔内,AD组将2 mL生理盐水注入关节腔内。缝合术口,无菌敷料覆盖,纱布绷带包扎。

所有患者的BMAC、PRP提取均由同一医生完成,关节镜术均由同一位高年资关节外科医生操作(若关节镜术中发现患者软骨损伤不符合纳入标准则剔除出组)。数据收集人员未参与注射,单人完成数据统计分析。

1.4 术后处理 患者注射后无疼痛,则不需服用任何处方药或非处方药;若疼痛难忍需向研究人员报告,并遵嘱服药。患者在注射后第4～5天开始持续被动运动,1周后开始负重,2周后可完全负重,建议在6个月时进行轻度体育活动(如游泳、骑自行车或慢跑),12个月后可参加不受限制的体育活动。

1.5 观察指标 注射前及注射后1、3、6、12个月采用Lysholm膝关节评分、Tegner运动能力评分、疼痛数字评分法(numeric rating scales,NRS)[8,14]评估患者症状及功能改善情况,通过患者书面填写问卷或由训练有素的医疗专业人员通过电话评估获得。注射前及注射后12个月由1名骨科医生和1名经验丰富的放射科医生采用三维磁共振软骨修复组织观察(magnetic resonance observation of cartilage repair tissue,MOCART)评分[15],评估软骨修复情况。

回顾性分析本院骨关节科2016年1月～2017年1月行TKA或UKA手术治疗的494位患者。其中199例符合上述标准，纳入本研究，其中男39例，女160例，平均年龄（69.84±6.43）岁。199个病例中，行UKA 94个膝关节，男20例，女74例；行TKA 105个膝关节，男14例，女91例。两组患者一般资料见表1，两组在年龄、性别构成、BMI、手术侧别的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2 结 果

62例患者均获得12个月以上完整随访,平均随访时间(14.16±0.94)个月。

2.1 Lysholm评分(见表2和图3) 三组组间比较,术前差异无统计学意义(P>0.05),术后1、3个月差异有统计学意义(P<0.05),术后6、12个月差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 三组Lysholm膝关节评分比较 图4 三组Tegner运动能力评分比较 图5 三组NRS评分比较

表2 三组患者Lysholm评分比较分)

AD+BMAC组术后1、3、6个月与术前比较差异有统计学意义(P<0.05),术后12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。AD+PRP组术后1、3个月与术前比较差异有统计学意义(P<0.05),术后6、12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。AD组术后1个月与术前比较差异有统计学意义(P<0.05),术后3、6、12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 Tegner评分(见表3和图4) 三组组间比较,术前差异无统计学意义(P>0.05),术后1、3个月差异有统计学意义(P<0.05),术后6、12个月差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 三组患者Tegner评分比较分)

AD+BMAC组术后1、3、6个月与术前比较差异有统计学意义(P<0.05),术后12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。AD+PRP组术后1、3个月与术前比较差异有统计学意义(P<0.05),术后6、12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。AD组术后1个月与术前比较差异有统计学意义(P<0.05),术后3、6、12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 NRS评分(见表4和图5) 三组组间比较,术前差异无统计学意义(P>0.05),术后1、3个月差异有统计学意义(P<0.05),术后6、12个月差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 三组患者NRS评分比较分)

AD+BMAC组、AD+PRP组术后1、3、6个月与术前比较差异有统计学意义(P<0.05),术后12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。AD组术后1个月与术前比较差异有统计学意义(P<0.05),术后3、6、12个月与术前比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 MOCART评分比较(见表5和图6) 三组组间比较,术前差异均无统计学意义(P>0.05);术后12个月AD+BMAC组、AD+PRP组略优于AD组,差异无统计学意义(P>0.05)。术后12个月三组患者MRI显示,软骨损伤均未加重,与术前比较均有改善,但MOCART评分与术前比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

图6 三组MOCART评分比较

表5 三组患者MOCART评分比较分)

2.5 典型病例 (1)37岁女性患者,因“左膝疼痛不适12个月”入院,诊断为左股骨软骨损伤,行AD联合BMAC治疗,术毕给予止痛、制动等处理,术后患者疼痛减轻,手术前后影像学资料见图7～8。(2)35岁男性患者,因“右膝疼痛不适20个月”入院,诊断为右股骨软骨损伤,行AD联合PRP治疗,术毕给予止痛、制动等处理,术后患者疼痛减轻,手术前后影像学资料见图9～10。

图9 术前MRI示右股骨软骨损伤 图10 术后12个月MRI示软骨缺损仍存在

3 讨 论

PRP是一种通过离心、分层分离等操作将外周血转变为含高浓度血小板的血浆制剂的一种制备方法,研究表明PRP中同时富含各类生长因子和抗炎细胞因子[16]。BMAC是通过将采集的自体骨髓离心,以浓缩血小板和骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal ceu,BMSCs)为目的进行制备[17-18],研究表明BMAC中的血小板、有核细胞浓度较未浓缩骨髓液增加了4倍[17],同时从中还检测出各类生长因子如血小板源性生长因子、人骨形态发生蛋白(human bone morphogenetic protein,BMP)-2等[13]。近年来,PRP及BMAC治疗膝关节疾病仍是生物制剂治疗的研究热点之一。

根据文献报道,当软骨损伤面积<3 cm2可采用生物制剂注射疗法[6],参考MRI及关节镜下检查,本研究对符合各项标准的ICRS Ⅰ～Ⅱ级膝关节软骨损伤患者应用AD联合BMAC或PRP治疗,比较分析其疗效结果表明,相较于单纯AD,辅助联合PRP或BMAC注射均能更显著改善患者症状、促进膝关节功能恢复。就PRP而言,本研究结果与Kon等[19]的研究结果一致,关节内PRP注射有助于膝关节软骨缺损患者的恢复。Laver等[20]、Bansal等[21]也曾开展试验对比PRP和透明质酸的疗效,大部分研究结果显示PRP组的效果好于透明质酸。机制上讲,这可能与PRP中富含各类生长因子和抗炎细胞因子有关。研究表明PRP中的生物活性因子能够恢复关节内透明质酸含量[22-23],增加糖胺聚糖和Ⅱ型胶原的合成,重建滑膜液稳态和促进组织修复[24];同时研究显示PRP在软骨治疗中具有生物胶功能,可调节关键的促炎介质和分解代谢酶,维持关节内稳态[25-26]。这不仅有利于去除坏死组织,减少炎症反应,而且有利于关节软骨的修复和再生。BMAC作为临床相关的抗炎和再生生物治疗的来源,在治疗膝关节损伤方面同样有效[6]。因BMAC来源于骨髓,研究普遍将其作用重点归功于其富含BMSCs。具体来讲,BMSCs可发挥招募作用,释放生长因子,诱导干细胞迁移到损伤区域并发挥抗炎作用;同时BMSCs的成软骨细胞分化和旁分泌信号产生强大的透明软骨修复组织反应,对修复软骨损伤有巨大的潜力[25,35]。总之本研究结果支持辅助联合PRP或BMAC使用能有效改善患者症状、促进膝关节功能恢复。

重要的是,本研究结果显示每个随访时间段AD+BMAC组患者症状及功能改善均优于AD+PRP组。这与Chahla等[7,28-29]的研究结果一致,BMAC较PRP治疗关节软骨局灶性损伤效果更佳。从机制上讲,BMAC除了含有PRP中存在的血小板和细胞生长因子外,还具备PRP没有的可促进软骨修复的其他生长因子如BMP-2、BMP-7[13],这些生长因子都已经被证明有利于促进软骨再生;同时BMAC因其骨髓来源、自身含有更丰富的BMSCs,而BMSCs在抗炎和组织愈合修复中发挥了至关重要的作用[30-31]。总之,可能得益于BMAC更丰富的干细胞和细胞因子成分,本研究中关节镜联合BMAC注射产生更优的治疗效果。

同时本研究发现,大部分患者短期内改善明显,长期效果不理想。这可能是因为BMAC、PRP中的许多生长因子等细胞成分具有有限的生物半衰期[32-33],其作用时间受到限制。同时软骨组织修复修复过程中需要足够的微环境给予支撑,应用关节镜结合生物制剂创造了良好的初始微环境,然而软骨缺损依然存在,且术后患者未完全制动,这有可能引起进一步软骨损伤的发生从而破坏微环境平衡,可能是短期内改善效果满意、长期改善不佳的原因。本研究显示PRP和BMAC注射后对症状、功能起到明显治疗效果分别能持续到到术后3个月和6个月;该结果可以为有效治疗时限的确定、注射次数及治疗周期的调整干预提供有效的参考。

在影像学分析中,本研究三组治疗12个月后MRI显示软骨损伤未进一步加重,但三组未发现明显的软骨修复差异。多项临床研究均报道了类似结果[21,34-35]。本研究中未出现明显新生软骨组织的原因可能为BMAC、PRP注射次数为1次,其所含相关细胞因子及生长因子半衰期较短,不能持续进行12个月的软骨修复作用;也可能因为关节局部软骨修复效果不明显,不能被常规MRI全部识别及显示,本研究中MRI观察序列为T1、T2序列,未应用基于MRI的形态成像和成分成像的成分MRI技术及特殊序列评估软骨修复程度,可能成像及评分不能精确反映软骨修复全部细节[15]。虽然MRI结果上观察各组差异无统计学意义,但BMAC+AD组、PRP+AD组患者各项功能评分较AD组均得到了明显提升,可见BMAC、PRP可阻止软骨损伤的进一步恶化,延缓了膝关节软骨损伤患者的骨关节炎进展。

本临床研究具有其局限性:考虑到每位患者可获得的BMAC、PRP样品量较少,未检测BMAC、PRP所含细胞成分及生长因子种类;同时考虑到患者骨髓采集后疼痛的持续时间,未进行多次BMAC、PRP注射;未检测患者关节液,不能对患者关节内微环境进行监测。

综上所述,相较于单纯AD,AD联合BMAC或PRP均能取得满意的近期疗效,可显著缓解症状和改善功能;AD联合BMAC效果优于PRP且作用持续时间更长。术后12个月影像学上评估BMAC和PRP注射对软骨修复有所帮助、能阻止膝关节损伤进一步恶化,但其优势不显著,有待进一步评估和研究。