消黄去疸汤对ANIT诱导的胆汁淤积性肝损伤大鼠的保护作用*

谭张奎 陈利锋 卢绮萍

1.中部战区总医院风湿免疫科 (湖北 武汉, 430070) 2.中部战区总医院普外科

胆汁淤积是由于胆管梗阻或胆汁的分泌-排泄过程受阻而引起的胆汁流动受损,胆汁不循常道流入血液的病理状态,临床可表现为全身或面色及小便发黄、乏力、瘙痒等[1]。胆汁淤积性肝损伤(CLI)由肝内胆汁酸代谢异常以及胆汁酸蓄积,导致的肝细胞和胆管细胞受损或死亡。临床中胆汁淤积患者可进一步发展为肝纤维化,严重者可发生肝衰竭[2]。CLI与中性粒细胞介导的炎症反应及其诱导的氧化应激有关[3]。目前对胆汁淤积引发损害的病因及机制知之甚少,极大地限制了新药治疗物的发现。目前治疗胆汁淤积的药物以熊去氧胆酸(UDCA)和S-腺苷蛋氨酸(SAMe)为主,而这两种药物副作用明显,部分患者对药物不敏感[4],临床治疗效果受限,因此寻求新的治疗药物迫在眉睫。祖国医学古籍中无胆汁淤积的病名,根据其症状表现可归属于“黄疸”范畴,消黄去疸汤来源于《石室秘录》,主治“黄疸,一身尽黄,面目亦黄者”。现代临床研究发现其治疗急性黄疸疗效显著[5],但缺乏进一步研究。本文旨在探索经典方剂消黄去疸汤的功效,进一步明确其应用范围,为临床提供依据,丰富中医药治疗肝胆疾病的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 28只8周龄SPF级雄性SD大鼠,体重150～200 g,由辽宁长生生物技术有限公司提供[许可证号:SCXK(辽)2022-0001]。饲养于温度20～25℃、湿度50%～70%环境,动物自由摄食饮水。本研究经过武汉华联科生物技术有限公司动物伦理委员会批准(HLK-20230415-001)。

1.2 药物及制备 消黄去疸汤由茵陈,薏苡仁、茯苓、车前子、肉桂组成,剂量比例为1∶3∶9∶0.2。以上药材采购于湖北省中医院中药房,药材混合后用6倍量纯净水浸泡1.5 h,先武火再文火煎煮1 h,去滓存液;重复煎煮1次,合并2次滤液,采用旋转蒸发器浓缩至终浓度0.66 g/ml(以生药量计),4℃冰箱保存备用。

1.3 试剂与仪器 α-萘异硫氰酸酯(ANIT)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。熊去氧胆酸(UDCA,国药准字号H20181059)购自湖北省中医院西药房。碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、还原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)试剂盒购自上海科艾博生物技术有限公司。总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、总胆汁酸(TBA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Trizol、dNTP、Taq DNA聚合酶试剂购自赛默飞公司。苏木精购自美国Sigma公司;伊红Y购自国药集团。

FlexStation 3型多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司。JA5003型电子分析天平购自上海舜宇平科学仪器有限公司。Chemray型全自动生化分析仪购自深圳雷杜生命科学股份有限公司。ICV-450型电热恒温培养箱购自日本ASONE公司。Nano-100微量分光光度计购自杭州奥盛仪器有限公司。HW-SY11-K电热恒温水浴锅购自北京市长风仪器仪表有限公司。EDC-810型PCR仪购自东胜创新生物科技有限公司。

1.3 分组、造模及给药 28只SD大鼠按照随机数字表法分为对照组(NOM)、模型组(MOD)、熊去氧胆酸组(UDCA)、消黄去疸汤组(XHQD),每组7只。NOM组与MOD组大鼠给予同体积的生理盐水灌胃,UDCA 组大鼠给予60 mg/kg UDCA灌胃,XHQD 组大鼠给予11.23 g/kg消黄去疸汤灌胃,连续7 d。于给药第5天时除NOM组外其余各组大鼠给予75 mg/kg ANIT橄榄油溶液灌胃复制CLI模型[6],NOM组大鼠给予相同体积的橄榄油灌胃。

1.4 监测各组胆汁淤积大鼠胆汁体积流量 各组大鼠腹腔注射麻醉,取仰卧位固定于手术台,剑突下开腹,进行胆总管插管手术留取胆汁。为了确保准确测量,插管5 min后对胆汁收集取样90 min,每15 min记录1次。胆汁体积流量=胆汁收集量/流出时间。

1.5 标本采集 标本采集前大鼠禁食不禁水12 h。第7天给药2 h后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,打开腹腔,使用负压管从腹主动脉采血。取出肝脏,称重后自肝右叶剪取一部分肝组织放入4%多聚甲醛中固定以备HE染色检查,一部分放入2.5%戊二醛溶液中固定以备电镜检查,剩余部分剪成若干小块分装于冷冻管后存于-80℃冰箱。采集的血液样静置1 h,3 000 rpm离心30 min,吸取上清液于离心管中,-80℃低温冰箱保存待检。

1.6 指标检测 采用全自助生化仪测定各组大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT活性及DBil、TBil、TBA水平。酶联免疫吸附法检测大鼠肝组织中SOD、GSH、MDA值。HE染色与透射电镜观察肝组织病理学变化。实时定量PCR(qRT-PCR)检测肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达,引物由华研生物科技有限公司合成,序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 结果

2.1 消黄去疸汤对胆汁淤积大鼠胆汁流量的影响 与NOM组比较,MOD组大鼠各个时间段胆汁流量均降低,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。与MOD组比较,UDCA组大鼠15、30、75、90 min时间段胆汁流量升高,差异具有显著统计学意义(P<0.05,P<0.01),45、60 min胆汁流量随升高,但差异无统计学意义(P>0.05);XHQD组大鼠各个时间段胆汁流量均升高,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠胆汁流量

2.2 消黄去疸汤对胆汁淤积大鼠血清中AST、ALT、ALP、γ-GT活性及肝脏指数的影响 与NOM组比较,MOD组大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量增加,肝脏指数升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与MOD组比较,UDCA组与XHQD组大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量减少,肝脏指数降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠血清AST、ALT、ALP、γ-GT含量及肝脏指数比较

2.3 消黄去疸汤对胆汁淤积大鼠血清中DBil、TBil、TBA水平的影响 与NOM组比较,MOD组大鼠血清DBil、TBil、TBA水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与MOD组比较,UDCA组与XHQD组大鼠血清DBil、TBil、TBA水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠血清中DBil、TBil、TBA水平

2.4 消黄去疸汤对胆汁淤积大鼠血清中SOD活性,GSH、MDA水平的影响 与NOM组比较,MOD组大鼠血清SOD活性及GSH水平降低、MDA水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与MOD组比较,UDCA与XHQD组大鼠血清SOD活性及GSH水平升高、MDA水平降,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见表5。

表5 各组大鼠血清中SOD、GSH、MDA及肝脏指数

2.5 消黄去疸汤对胆汁淤积大鼠肝脏组织病理变化的影响 NOM组大鼠肝脏组织结构正常,肝细胞索状排列整齐,肝细胞间肝窦明显,未见明显组织病理损伤改变。MOD组大鼠肝组织形态脂质样沉积严重,细胞核固缩脂肪样变性,汇管区周围有结缔组织增生,伴随少量零散炎性细胞浸润,汇管区见胆管上皮细胞及纤维细胞增生。UDCA组与XHQD组大鼠肝组织汇管区周围虽有少量结缔组织增生,可见少量炎性细胞浸润,但病变均有改善。见图1。

图1 各组大鼠肝脏组织病理学改变 (HE染色,上:100×,下:200×)

NOM组大鼠的肝细胞超微结构表现出核膜完整、粗面内质网、线粒体清晰可见,结构正常。MOD组大鼠的肝细胞表现出细胞器排列紊乱,脂滴明显,线粒体水肿,胞质空泡化、毛细胆管微绒毛减少以及胆汁淤积等现象。UDCA组与XHQD组大鼠肝细胞内各细胞器的依然有损害现象,但线粒体、内质网、胞核超微结构病变较轻。见图2。

图2 各组大鼠肝细胞超微结构改变 (透射电镜,1 700×)

2.6 消黄去疸汤对胆汁淤积大鼠肝脏TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达的影响 与NOM组比较,MOD组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与MOD组比较,UDCA组与XHQD组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表6。

表6 各组大鼠肝组织TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平

3 讨论

随着饮食结构、生活环境以及生存压力变化,情绪的变化严重影响肝胆代谢。中医理论认为肝主疏泄,情志抑郁引起肝失疏泄,胆汁不能正常排泄,胆汁淤阻、蓄积,过量胆汁酸在肝内积聚,造成肝脏损伤。ANIT可引起肝细胞和胆道上皮细胞的损伤和坏死,破坏胆汁酸稳态,在啮齿类动物中常用于诱导胆汁淤积,给药后动物模型的生化和病理变化包括转氨酶升高、胆汁酸水平紊乱、肝细胞凋亡或坏死等,与临床肝内胆汁淤积症状相似[7]。

广泛存在于肝细胞中的ALT、AST在肝细胞受损后被释放到血液中,导致血液中ALT和AST浓度升高。ALT是早期肝损伤的主要指标,AST升高提示肝细胞坏死,反映肝损伤程度。ALP和γ-GT升高常见于肝内外胆管阻塞性疾病,胆汁淤积性肝损伤时出现明显升高[8]。TBil、DBil、TBA是临床诊断胆汁淤积的重要指标。本研究结果显示,MOD组大鼠血清中肝功能相关指标明显升高,肝脏病理切片观察到肝细胞萎缩呈严重长梭状形态,肝窦和汇管区见炎性细胞浸润,汇管区见胆管上皮细胞及纤维细胞增生,胆汁体积流量明显降低,大鼠出现明显的胆汁淤积。UDCA组及XHQD组大鼠上述指标与病理表现均得到明显改善,且XHQD组大鼠改善程度更好,提示消黄去疸汤能够改善并修复大鼠肝细胞的损伤,促进胆汁代谢及排泄,效果优于UDCA组。

SOD、MDA及GSH是机体氧化应激及自我修复的常用指标。有文献报道SOD活性降低、MDA和GSH水平升高均提示体内存在一定程度的氧化应激损伤[9],与本文研究一致。与MOD组相比较,XHQD组大鼠SOD活性提高, MDA和GSH水平降低,提示消黄去疸汤能够缓解肝组织细胞氧化应激损伤。肝脏中TNF-α的过度表达可诱导产生氧自由基以及脂质过氧化,从引起肝损伤[10]。TNF-α作为促炎因子,可激活肝星状细胞,同时可促进IL-1β、IL-6等的表达,放大炎症反应[11]。因此,在胆汁瘀积性肝损伤的疾病中IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子发挥重要作用[12]。本研究发现,模型大鼠肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平升高,XHQD组相应指标均明显降低,提示消黄去疸汤能够改善胆汁淤积肝损伤炎症反应。

总之,消黄去疸汤通过降低胆汁淤积性肝损伤大鼠的炎症状态,改善肝功能水平,调整氧化应激水平,从而起保护作用。本文为消黄去疸汤的临床应用及基础研究提供了数据支持,但中药复方存在多成分、多靶点的特点,其有效成分及具体机制尚不明确,有待进一步研究。