凝血机理概述、凝血组合物开发及其在口腔护理产品中应用
2023-11-01李立芬邱淑婷邬凤娟李梦蝶
李立芬 邱淑婷 邬凤娟 李梦蝶
(广州星际悦动股份有限公司,广东 广州 510610)
牙龈健康是口腔健康的基础。随着社会的不断进步,人们面临的工作、情感、 生活压力越来越大,不规律的饮食习惯,不规范的口腔清洁操作,日益低下的机体免疫力,共同作用导致了各种牙龈问题。
牙龈出血是牙龈炎主要临床表现,常作为口腔科门诊就诊原因。根据《第四次全国口腔健康流行病学》调查报告数据,牙龈出血检出率:35~44岁年龄组 87.4%,人均有牙龈出血牙数为13.77颗;55~64年龄组 88.4%,人均牙龈出血牙数13.87颗;65~74年龄组 82.6%,人均有牙龈出血的牙数为11.25颗。牙龈出血困扰着我国相当大比例的人群,开发具有改善牙龈出血的口腔护理产品很有市场前景。
1 机体凝血系统
正常生理情况下,血液在循环系统中流动,一方面必须保持流体状态不发生凝固,另一方面一旦创伤可通过正常止血机制达到止血目的;正常止血机制包括血管收缩、血小板反应、凝血与抗凝系统、纤溶系统。凝血与抗凝保持动态平衡,平衡失调及异常出血或者导致血栓形成。
图1
血液凝固简称凝血,是血液由流动状态变为凝胶状态的过程,它是止血功能的重要组成部分。凝血过程是一系列凝血因子被相继酶解激活的过程,最终生成凝血酶,形成纤维蛋白凝块。迄今为止,参与凝血的因子共有12个[1]。
根据凝血瀑布学说[2,3],人体凝血可分为三个阶段:凝血酶原激活物的形成阶段、凝血酶原变为凝血酶的阶段、在凝血酶作用下纤维蛋白原变为纤维蛋白阶段。凝血过程通常分为内源性凝血途径、外源性凝血途径、共同凝血途径。内源性凝血途径指参加的凝血因子全部来自血液,临床上常以活化部分凝血活酶时间反映体内内源性凝血途径的状况。外源性凝血途径是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中,还有外来的凝血因子参与止血,临床上以凝血酶原时间测定来反映外源性凝血途径的状况;从因子X被激活至纤维蛋白形成,是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。
2 口腔护理产品常见凝血功效成分
2.1 中药成分及作用机制
我国中药资源十分丰富,有几千年的临床应用。受环保、绿色生活理念影响,中药牙膏在市场上的地位越来越高,种类也越来越多,例如云南白药、田七、两面针、草珊瑚等。中药牙膏因药性缓、毒副作用小,能有效改善各种口腔问题,如抑菌、护龈、防龋等,深受消费者喜爱。
三七是应用最广的止血中药。据《本草新编》记载:“三七根,止血之神药也。”三七根是主要药用部位,主要成分是皂苷,止血有效成分是水溶的三七素。三七素能增加血小板的数量,影响血小板的变形,缩短凝血酶原时间,释放组胺刺激血管收缩,起到止血效果[4,5]。三七还具有抗炎、镇痛的作用,为三七应用于口腔护理产品提供了理论依据。
2.2 凝血酸作用机制
凝血酸又名氨甲环酸、传明酸,于1954年发现其具有抑制纤维蛋白溶酶与纤维蛋白结合,从而抑制由纤溶酶所导致纤维蛋白分解,促进机体凝血作用[6,7]。凝血酸是一种较强的止血剂,在医学临床已广泛应用于减少术中或者术后的出血。凝血酸因其止血作用,近年也被用于护龈牙膏中,其中比较典型的为云南白药牙膏。
2.3 多糖类止血成分及作用机制
多糖类物质(如甲壳素、海藻酸盐、淀粉类)具有良好的生物相容性、可降解性,已被广泛用于生物医学领域,其中应用最广泛的为甲壳素。甲壳素是熊甲壳类动物中提取出来的天然多糖,结构类似于植物纤维素,脱乙酰后为壳聚糖(脱乙酰壳多糖),壳聚糖具有广泛的抗菌性和强黏附性,已被美国食品药品监督管理局批准并广泛用于绷带、敷料等止血材料。带有阳离子的壳聚糖可以与红细胞表面阴离子相互作用, 使红细胞在损伤部位迅速聚集,增强血小板向血管壁运动,还可以激活、加速血小板黏附和聚集,从而形成血块起到止血效果[8]。此外壳聚糖也可以通过血浆蛋白和凝血因子,修饰蛋白功能强化血凝块加强止血,发挥良好的止血效果。
2.4 无极类止血成分及作用机制
沸石、粘土和高岭土都是天然来源的多孔硅酸盐矿物质,具有较强的吸水能力和良好的止血效果。无机类止血材料主要通过吸收血液中水分、浓缩凝血因子和血小板等血液成分发挥止血作用。沸石还可以通过释放钙离子激发凝血瀑布反应[9]。无机类止血材料在口腔护理产品中应用相对较少。
2.5 蛋白类类止血成分及作用机制
蛋白类止血材料主要包括胶原蛋白、明胶、纤维蛋白等[10]。胶原蛋白及其衍生物明胶是另一类常用于止血的生物活性材料。损伤发生后,胶原暴露在血液中,血小板通过胶原粘附、聚集和活化,启动凝血反应。胶原蛋白类成分因其来源及成本控制,目前主要应用于偏药用口腔护理产品。
3 凝血组合物开发
3.1 白及根提取物
白及作为一种珍贵中药材,属多年生陆地兰科草本植物;白及又名白芨、白及粉、白及子,白及药用价值较高,《神农本草经》显示白及味苦涩,有消除痈肿,恶创出血的药效[11]。《本草纲目》记载白芨连茎而升,性涩,有入肺止血,止外伤出血,生肌治疮的药效[12]。研究表明[13,14]白芨多糖可通过促进活化凝血酶止血机制,缩短机体出血时间及凝血时间,具有较好的止血效果。
白及富含多糖、黄酮、皂苷等多种活性成分,具有止血、消炎、生肌、促进组织再生等作用[15]。因此在口腔护理产品中具有重要的研究价值。
3.2 脱乙酰壳多糖
脱乙酰壳多糖来源于生物体,具有良好的相容性,是近年来止血性生物材料的研究热点之一。脱乙酰壳多糖具有很多生理活性,如抗菌、止血、促伤口愈合[16~18]等,在医药、生物、化工、食品等领域有很好的应用前景。
不同于常规的“瀑布理论”止血机制,脱乙酰壳多糖可在病学因子缺乏情况下诱导血块形成,也可在肝素化条件下保持凝血活性。脱乙酰壳多糖带正电荷,可通过离子作用力使带负电荷红细胞凝集起到凝血效果,还可以通过对血小板刺激作用、活化补体系统及其他血液成分促凝途径实现止血效果[19]。
本研究选用采用独立于凝血级联反应之外的静电凝血机理实现凝血的脱乙酰壳多糖,复配通过活化凝血酶,作用纤维蛋白原转化为纤维蛋白实现凝血的白及根提取物做凝血组合物,与机体机体自身的凝血级联反应形成协同凝血作用,从而促进凝血。用于在口腔护理产品中应用及功效测试。
4 凝血组合物在口腔护理产品中应用及功效测试
4.1 口腔护理产品中应用
通过大量配伍性试验研究,将凝血组合物应用于口腔护理产品,复配其他护龈功效组合物,研制开发含有白及根提取物、脱乙酰壳多糖组合物的护龈口腔护理产品,并经过稳定性考察,产品正常,符合牙膏、漱口水国家标准要求。
4.2 功效验证
4.2.1 凝血酶时时间(TT)测定
测试机理:在血浆中加入标准化的凝血酶后血液凝固的时间。在共同凝血途径中,所生成的凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白,可用TT表示,是反映外源性凝血是否正常的重要指标,也是临床常用指标。
测试步骤:以无菌水作为溶剂,按一定比例将待测样配成一定浓度的供试品溶液,以0.9%生理盐水为空白对照,低温储存备用;猪血浆在3000rpm 4℃离心15min,制备血浆,低温冷藏 备用;取待测血浆 0.1ml, 加入 0.1ml配置好的供试品样品溶液,空白对照加入加入0.1ml生理盐水混匀,37℃水浴孵育3min,加入凝血酶0.1ml混匀,立即启动秒表,记录凝固时间,即为TT值。每个样品重复10次,取平均值。
含凝血组合物牙膏/漱口水、阴性对照样(生理盐水组)、阳性对照样(市售宣称凝血牙膏)TT测试数据如表1所示。
表1 几组样品的TT值
根据凝血酶时间测试试验结果,含凝血酶的口腔护理产品TT值明显小于阴性对照(生理盐水),且小于市售宣称有止血效果的护龈牙膏。试验结果表明,含凝血组合物的口腔护理产品能明显缩短凝血酶时间,具有凝血效果。
4.2.2 抗凝血程度(BCI)测定
测试步骤:真空抽取1名健康志愿者外周血(两周内未服用任何抗凝血药物),3.2%柠檬酸钠抗凝,待用;取50ul待测样加入到上述抗凝全血,37℃恒温30min;取50ul 0.2M CaCl2加入上述抗凝全血,混匀,移液枪吸取复钙抗凝全血10ul加入24孔板表面,37℃静止孵育3、5、10min,加入1ml去离子水,振动10min,使未凝固的红细胞发生凝血;移液枪移取上清液到离心管,高速离心10min,取上清液200ul加入96孔板,用酶标仪测量溶液在540nm波长处的吸光度,重复测试3次,取均值。
BCI值计算公式如下,Ia表示复钙抗凝全血与试样接触设定时间后溶液吸光度;Iw表示抗凝全血与去离子水混合后溶液吸光度。BCI越小,凝血效果越强。
试验测试了几组原料/组合物和牙膏成品样BCI值,测试结果如图2、图3所示。
图2 几组凝血原料/组合物BCI值
图3 几组牙膏样BCI值
根据抗凝血程度测试试验结果,组合物凝血效果优于单一原料以及凝血酸凝血效果,含组合物牙膏凝血效果优于含单一原料牙膏,且凝血效果相当或优于市售主打凝血效果牙膏。试验结果表明,凝血组合物有较好协同凝血作用,含组合物的牙膏具有很好的凝血效果。
4.2.3 消费者测试
测试方法:本研究采用委外检测方法,由具有相关资质的第三方检测机构征集具有牙龈炎症志愿者(受试者),使用含凝血组合物护龈牙膏每天早晚刷牙两次,共使用14天,于使用测试样品的1次、7天、14天后对消费者牙龈状态进行问卷填写,如牙龈问题减轻程度、牙龈肿痛减轻程度、牙龈出血减少情况等,进而评估该牙膏护龈、凝血效果。
含凝血组合物牙膏对牙龈问题改善结论如下:
80%受试者认为,初次使用产品,牙龈出血得到改善,改善程度75%;
连续使用产品1周,95%受试者认为牙龈出血有改善,改善程度87.3%
连续使用产品1周,90%受试者认为牙龈问题减轻,减轻程度86.7%;
连续使用产品1周,88%受试者认为牙龈肿痛问题有所改善,改善程度88.9%;
100%受试者认为,使用产品两周牙龈出血得到改善,改善程度95.2%;
100%受试者认为,使用产品两周牙龈问题有所改善,改善程度90.1%;
100%受试者认为,使用产品两周牙龈肿痛有所改善,改善程度94.2%;
消费者试验结果表表明,含凝血组合物的护龈牙膏具有较好的即时凝血效果,使用1周能有效改善牙龈胀痛、牙龈出血等牙龈问题。
5 结论
使用脱乙酰壳多糖、白及根提取物的凝血组合物,复配其他护龈功效成分的口腔护理产品,能有效预防或者改善牙龈肿痛、牙龈出血等牙龈问题。