大黄酸对革兰阴性菌的体外抑菌作用及其机制研究

古卓强,梁文辉

作者单位： 510405 广州市,广州中医药大学第一附属医院

革兰阴性菌指革兰氏染色反应呈红色的细菌,常见的有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍氏不动杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、嗜水气单胞菌,是临床颅脑[1]、呼吸道[2]、胸腹腔[3]、胆道[4]、泌尿道[5]、血流[6]等感染性疾病的主要致病原。据2021年CHINET中国细菌耐药监测结果显示,2021年共收集国内主要地区51所医院临床分离菌301 917株,其中革兰阳性菌占28.6%,革兰阴性菌占71.4%[7];中国细菌耐药监测研究2019—2020革兰阴性菌监测报告中显示,大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等为临床上易产生耐药的主要致病菌,且其多重耐药菌(MDR)、泛耐药菌(XDR)问题日益突出[8]。由于革兰阴性菌自身的特殊结构,药物较难以有效渗透而发挥抗菌作用,同时因乱用、滥用引发的耐第三代头孢菌素大肠埃希菌、耐碳青霉烯绿假单胞菌等耐药性问题,使得临床上缺乏安全有效的用于治疗耐药革兰阴性菌感染的药物,严重威胁人类健康[9]。

近年来,研究发现,中草药的单体化合物对革兰阳性菌、革兰阴性菌均有不同强度的抗菌活性,表现出广谱抗菌作用[10];同时对细菌的代谢活动调控、细胞膜通透性、生物膜形成、耐药质粒产生等方面均可发挥作用,表现出多途径抑菌作用。因此,在新型抗生素研发时,从中草药天然产物寻找和开发抗菌先导化合物具有重要的实际意义,可为临床治疗感染性疾病快速提供新的药物方案。本研究选用大黄酸为受试药物,开展对革兰阴性菌的抗菌活性及作用机制研究,为临床治疗细菌感染性疾病提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 标准菌株:大肠埃希菌ATCC25922,福氏志贺氏菌CMCC(B)51572,绿脓杆菌ATCC9027,副溶血弧菌ATCC17802(广东环凯微生物科技有限公司提供);鲍曼不动杆菌ATCC19606,肺炎克雷伯菌ATCC10031(广东省微生物菌种保藏中心提供)。

1.2 试剂与仪器 大黄酸(上海源叶生物科技有限公司提供);TSA培养基、TSB培养基、0.5%TTC溶液(青岛海博生物技术有限公司提供);BCA试剂盒[江苏宝莱(酶免)生物科技有限公司提供];二甲基亚枫(天津市富宇精细化工有限公司提供);SW-CJ-1FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司生产);LX-280D型压力蒸汽灭菌器(合肥华泰医疗设备有限公司生产);PH-050A恒温培养箱(上海一恒科技有限公司生产);MultiskanTMFC 酶标仪(ThermoFisher公司生产)。

1.3 实验方法

1.3.1 药液制备:称取大黄酸20 mg,先加入二甲基亚砜溶液50 μl,振荡溶解,再加入无菌水定容至1 ml,制备成10.0 mg/ml的溶液,置于冰箱4 ℃保存备用。

1.3.2 菌液制备:将标准菌株接种于已灭菌的液体培养基中,37 ℃培养20 h,与麦氏比浊管比对,用无菌生理盐水配制成0.5个麦氏浊度,即1×108CFU/ml。

1.3.3 最低抑菌浓度(MIC)测定[11]:取96孔板,在每横排孔中加入菌液100 μl,再加入100 μl“1.3.1”项下大黄酸溶液至第1孔,吹打混匀,采用倍比稀释法,使得混合液中大黄酸质量浓度依次为10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.078、0.039、0.020 mg/ml,以5%二甲基亚砜溶液和菌液为阳性对照,肉汤培养基和菌液为阴性对照,每孔再加入10 μl的0.5%TTC溶液,实验平行3份;将96孔板置于37 ℃培养箱中培养20 h,取出后根据颜色变化进行判别,无颜色变化者即为MIC。

1.3.4 最低杀菌浓度(MBC)测定:选取大黄酸质量浓度为MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC对应孔,吸取50 μl混合液进行涂板,将琼脂板置于37 ℃培养箱中培养20 h,以菌落数≤5个者为MBC。

1.3.5 细胞膜内含物外泄量测定[12]:将对数生长期浓度的菌液比浊稀释至1×108CFU/ml,取适量于试管中,加入大黄酸溶液使得质量浓度为MIC,以5%二甲基亚砜溶液和菌液为对照组,置于37 ℃培养箱中培养12 h,每隔4 h取出,在4 500 r/min离心15 min,采用酶标仪测定上清液的A260值,评价核酸外泄量水平;同时将上清液加样至BCA试剂盒,采用酶标仪测定A562,计算蛋白质外泄量;实验平行3份。

2 结 果

2.1 大黄酸对革兰阴性菌的MIC测定 大黄酸对大肠埃希菌、福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、副溶血弧菌的MIC范围为0.31～5.00 mg/ml。MIC测定结果显示,大黄酸对不同革兰阴性菌的作用强弱依次为:副溶血弧菌>福氏志贺氏菌>鲍曼不动杆菌/肺炎克雷伯菌>绿脓杆菌>大肠埃希菌,其中对副溶血弧菌的抗菌作用最强,对大肠埃希菌的作用则最弱,见表1。

2.2 大黄酸对革兰阴性菌的MBC测定 大黄酸对大肠埃希菌、福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、副溶血弧菌的MBC范围为0.63～10.00 mg/ml。MIC测定结果显示,大黄酸对不同革兰阴性菌的作用强弱依次为:副溶血弧菌>福氏志贺氏菌>鲍曼不动杆菌>肺炎克雷伯菌>绿脓杆菌/大肠埃希菌,其中对副溶血弧菌的抗菌作用最强,对大肠埃希菌、绿脓杆菌的作用则最弱,见表2。

表2 大黄酸对革兰阴性菌的MBC测定结果

2.3 大黄酸作用后大肠埃希菌细内含物外渗量测定 在12 h培养时间内,大肠埃希菌对照组的A260值随时间延长而略有升高,但无明显变化,大黄酸组的A260值随时间延长而升高,即在大黄酸作用下,大肠埃希菌细胞膜内核酸外泄量明显增加,见图1。大肠埃希菌对照组细胞膜内蛋白质含量亦随时间的延长而略有升高,但无明显变化,大黄酸组大肠埃希菌细胞膜内蛋白质外泄量随时间延长而升高,即在大黄酸作用下,大肠埃希菌细胞膜内蛋白质外泄量明显上升,见图2。

图1 大黄酸作用后大肠埃希菌细胞膜内核酸外泄量变化图

图2 大黄酸作用后大肠埃希菌细胞膜内蛋白质外泄量变化图

3 讨 论

大黄酸为蒽醌类化合物,存在于大黄、决明子、虎杖、芦荟等多种中草药中,药物资源丰富。现代药理学研究表明,大黄酸具有抗菌[13]、抗病毒[14]、抗肿瘤[15]、抗炎[16]、抗氧化[17]、抗纤维化[18]、降血糖[19]、降血脂[20]等药理作用。但是现有研究表明,大黄酸的抗菌作用多见于革兰氏阳性菌,如对金黄色葡萄球菌[21](MIC为50 μg/ml)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[13](MIC为8 μg/ml)、伪中间葡萄球菌[22](MIC为12.5 μg/ml)、木糖葡萄球菌[23](MIC为64 μg/ml);仅见于对猪胸膜肺炎放线杆菌革兰阴性小杆菌[24](MIC为25 μg/ml)。

本研究发现,大黄酸对大肠埃希菌、福氏志贺氏菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌、副溶血弧菌等临床常见的革兰阴性菌作用较为明显;在对受试菌株的不同作用强度进行比较时发现,大黄酸对副溶血弧菌尤为敏感,作用最强。在大黄酸作用后,大肠埃希菌细胞膜内的核酸、蛋白质外泄量明显增加,表明大黄酸在MIC下,能够引起细菌细胞膜的破裂,使得DNA、RNA等大分子物质及蛋白质等内含物外泄,因此作用机制为破坏细胞膜完整性而起到有效的抗菌作用。这是因为大黄酸能够有效破坏细菌细胞膜完整性,改变其通透性,使得核酸、DNA、RNA等物质外泄,导致菌体凋亡,这为临床应用于治疗由革兰阴性菌引发的感染性疾病提供初步的实验依据和可行性。在下一步工作中,将重点研究大黄酸对革兰阴性菌及其耐药菌的细胞壁、生物被膜、群体感应方面的作用机制,以及大黄酸与临床常用抗生素的协同抗菌作用,以便更好地为临床治疗细菌感染性疾病提供理论依据,也有助于更好地从传统中草药中发掘抗菌新药物。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。