无糖组培条件下猕猴桃茎尖快速生根试验

王中月,王 健,张阿玲,刘艳飞,刘占德

(西北农林科技大学 园艺学院,陕西杨凌 712100)

中国作为猕猴桃的原产地,栽培面积和产量均位于世界第一[1]。猕猴桃因其营养价值高,风味佳深受消费者喜爱,市场对猕猴桃的需求量也日益增加,因此扩大猕猴桃优质苗木生产迫在眉睫[2-3]。近些年,组织培养快繁技术成为猕猴桃良种繁育的重要途径[4],然而组织培养中蔗糖的使用会大幅增加组培苗的污染率[5],且密闭的培养环境也不利组培苗生根[2]。因此,生产中急需一种技术解决上述难题。

无糖组培快繁技术是日本千叶大学古在丰树教授在20世纪80年代末发明的一种全新植物组织培养技术[6-10],是环境调控技术和组织培养技术的结合[11-14],其原理是以CO2代替糖类作为植物的碳源,通过调节培养容器内的微环境使植物进行光合作用,进而促进植物快速生根和生长[15-21]。中国自1994年引进无糖组培快繁技术以来,相继应用在非洲菊[12]、满天星[15]、薄叶金花茶[18]、欧李[19]、半夏[20]、金线莲和铁皮石斛[21]等植物上。而关于无糖组培快繁技术在猕猴桃种苗繁育方面的应用尚未见报道。

因此,本研究通过比较分析无糖组培和传统有糖组培方式对猕猴桃茎尖生根效率的影响,并初步探究了不同条件下根系相关酶活、内源激素的变化,以期为构建猕猴桃无糖组培快繁技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以苗龄为6周,生长健壮、长势相近的中华猕猴桃‘脐红’和美味猕猴桃‘郁香’组培苗为试材。

1.2 试验处理

1.2.1 最佳基质含水量筛选 将试材分别接种至含水量为50%、60%、70%、80%、90%的蛭石基质(450 g蛭石+1/2 MS+1.0 mg/L IBA)中培养。每个处理设置3个重复,每个重复30株苗。培养28 d后统计并记录幼苗的株高、茎粗、叶绿素含量、根数、平均根长、根表面积、根体积等生长指标。

1.2.2 最佳CO2浓度和换气方式筛选 将试材置于光自养快繁装置中进行CO2富集培养,通过控制器将CO2浓度设置为800和1 200 μmol/mol,换气方式设置为自然换气、间隔15 min强制换气和间隔30 min强制换气。每个处理设置3个重复,每个重复30株苗。培养28 d后统计相关生长指标,同“1.2.1”。

1.2.3 无糖组培和有糖组培对比试验 将试材分别接种在传统有糖培养基(1/2 MS+25 g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂+0.5 mg/L IBA+0.3 mg/L IAA,pH=5.8)和无糖培养基(450 g蛭石+1/2 MS+1.0 mg/L IBA,pH = 5.8)中培养。每个处理设置3个重复,每个重复30株苗。

光自养无糖组培快繁装置购于上海离草科技有限公司,培养前期通气流量为1.0 ± 0.2 L/min,生根培养后期,通气流量为2.0 ± 0.2 L/min。其他培养条件均相同:光周期为14 h/10 h(光/暗),光照度为2 500～3 000 lx;培养温度为(24±2) ℃。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 猕猴桃根系指标的测定 生根培养28 d后随机选取30株幼苗进行根系构型相关参数的测定。取幼苗根部,清洗干净后于水中展开,用ScanMakeri 800 plus扫描仪获取根系扫描图像,利用Win RHIZO软件对幼苗根系长度、表面积、体积、根尖数、直径等参数进行分析[5]。

1.3.2 猕猴桃生根过程中相关酶活性及内源激素的测定 分别于生根培养的第1、4、7、14、21、28天进行随机取样,用纯水清洗干净擦干后分别将叶片、茎基部擦干后放入液氮速冻,于-80 ℃超低温冰箱保存,用于相关酶活性及内源激素的测定。

POD、PPO和IAAO活性参照文献[22-23]的方法进行测定。相关内源激素参照文献 [24-25]的方法提取,采用超高效液相串联质谱法(UHPLC-MS)测定。

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2019对试验数据进行整理和作图,用SPSS 21.0软件,采用独立样本T检验方法、one-way ANOVA方法和LSD多重比较(P<0.05)对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同基质含水量对无糖组培猕猴桃幼苗生长的影响

基质作为植物生长的支撑材料,不仅起固定作用,而且与植物吸收水分和养分、根系呼吸等生理反应密切相关。只有基质满足根系对水分的需求,才能让幼苗根系发达。由表1可知,‘郁香’和‘脐红’在含水量为70%、80%和90%的基质中生根率、存活率等生长指标显著优于含水量为50%和60%的基质,说明基质含水量对无糖组培苗不定根的形成至关重要。当基质含水量为80%时‘郁香’和‘脐红’的生根率最高,分别为81.48%和81.67 %;当基质含水量为70%时‘郁香’和‘脐红’的成活率最高,分别为96.30%和 92.59%。而‘郁香’和‘脐红’的株高、茎粗及叶绿素含量在基质含水量为70%、80%和90%的处理间没有显著性差异(表1)。

表1 不同基质含水量处理下猕猴桃幼苗生长情况Table 1 Effects of different substrate water content on growth of kiwifruit seedlings

2.2 CO2浓度及换气方式对无糖组培猕猴桃幼苗生长的影响

由表2可知,在800和1 200 μmol/mol 的处理条件下,2个品种生根率并无明显差异,因此从节约成本的角度考虑,选择800 μmol/mol较为合理。在相同CO2浓度中,随着换气间隔时间的增加,无糖组培苗生根率呈下降趋势,说明在保证幼苗正常生长的前提下,缩短强制换气的时间间隔有助于提高2个品种的生根率。2个品种在强制换气处理下的生根率都极显著高于自然换气处理,且间隔15 min强制换气的生根率最高(‘脐红’为86.11%,‘郁香’为77.78%)。说明强制换气能够增加无糖组培苗的生根率。存活率、株高、茎粗、叶绿素含量在不同 CO2浓度及换气方式处理间差异不明显。

表2 不同CO2浓度和换气方式下猕猴桃幼苗生长Table 2 Effects of CO2 concentration and ventilation mode on growth of kiwifruit seedlings

2.3 无糖组培方式对猕猴桃茎尖生根的影响

由表3可知,2种生根培养方式对猕猴桃组培苗根系的各指标有不同影响。整体来看,‘郁香’和‘脐红’通过无糖组培的生根效果明显好于作为对照的传统有糖组培。无糖组培条件下,‘脐红’和‘郁香’在培养第7天已形成少量根系,而此时在对照有糖组培中只在茎尖基部形成少量愈伤组织(图1-A,1-B)。在培养第14天,无糖组培条件下的‘脐红’和‘郁香’根系快速增长,形成大量次级根,而对照仅形成极少量根系且几乎无侧根。培养第28天,无糖组培条件的2个品种均已形成完整的根系,利于吸收营养对移栽驯化有积极作用,而对照仅有少量根系和极少量侧根;且无糖组培条件下‘郁香’和‘脐红’的总根长、总根表面积、根尖数、分支数均极显著高于对照,总根体积显著高于对照(表3);但平均根系直径极显著低于对照有糖组培。

图1 2种组培生根方式下‘郁香’和‘脐红’根系发育情况Fig.1 Rooting development of ‘Yuxiang’ and ‘Qihong’ under two rooting methods of tissue culture

2.4 无糖组培生根过程中3种抗氧化酶活性的动态变化

由图2-A可知,无糖组培‘郁香’的POD活性呈先升高再下降的趋势;而在常规有糖组培的POD活性变化相反。‘郁香’在无糖培养生根的第4天和第7 天,POD活性分别为30.71和 23.48 U/(g· min),极显著高于对照13.31和3.90 U/(g· min)。由图2-B可知,‘脐红’组培苗在生根过程中,无糖组培和传统有糖组培的POD活性变化趋势相似,呈现“上升-下降”的单峰趋势。‘脐红’在生根培养的第7天,POD活性达104.55 U/(g· min),极显著高于对照85.56 U/(g· min)。说明生根过程中,较高POD活性有利不定根形成。

* 表示差异显著(P<0.05),** 表示差异极显著(P<0.01)。下同

‘郁香’在无糖组培生根的第1天和第4天,PPO活性显著高于对照,分别是对照的2.64和3.23倍。表明在生根初期,PPO活性高利于产生不定根。在2种生根条件下,‘脐红’PPO活性在第4天时均达到最高,但二者无显著性差异(图 2-C,2-D)。

无糖组培生根第7天时(图2-E,2-F),‘郁香’和‘脐红’的IAAO活性均为最高,分别为 15.27和31.63 U/(g·min),分别显著高于对照的6.33和8.87 U/(g· min)。说明IAAO活性的增加利于不定根的伸长。

2.5 无糖组培生根过程中相关内源激素的动态变化

‘郁香’和‘脐红’在2种生根方式培养的过程中IAA含量总体呈先降低后升高的“V”形变化趋势(图3-A,3-B)。无糖组培的第1天,‘郁香’和‘脐红’的IAA含量最高,分别为6.84和7.45 ng/g,均显著高于对照;随后逐渐下降直到第14天时,达到最低值1.29和1.01 ng/g,且显著低于对照;之后逐渐升高,到第28天时显著高于对照。结果说明生根前期,IAA含量高利于不定根 形成。

图3 无糖组培生根过程中幼苗IAA、ABA和GA3含量变化Fig.3 Changes of IAA,ABA and GA3 contents in seedlings during rooting in sugar-free tissue culture

‘郁香’和‘脐红’在2种生根方式培养的过程中ABA含量总体上呈先升高后降低的趋势(图3-C,3-D)。二者均在无糖组培的第7天ABA含量最高且极显著高于对照;且‘郁香’在第14天和第21天时,ABA含量仍极显著高于对照;而‘脐红’在第14天和第28天时,ABA含量也极显著高于对照。说明生根中期,高浓度ABA有利于不定根的伸长。

由图3-E、3-F可知,无糖组培条件下,‘郁香’在第4天时GA3显著高于对照,第7天时含量达到最高,但与对照相比无显著性差异。而‘脐红’除了第4天,无糖组培条件下的GA3含量始终显著高于对照,且在第14天时含量最高,达到 100.46 ng/g。表明生根后期,高浓度GA3促进不定根伸长和侧根形成。

3 讨论与结论

植物生根率与基质含水量密切相关,不定根形成时期的基质含水量应维持在70%～80%,这样既能满足根系对水分的需求又不易导致其腐烂[23]。本试验无糖组培条件下基质含水量为80%,猕猴桃组培苗的根系生长良好(表1)。有糖组培生根采用琼脂作为支撑材料,其凝固后结构致密,通透性差,故根系形态发育受阻;而无糖组培使用疏松多孔的蛭石,有助于幼苗根系的伸展,同时搭配强制换气利于根系的呼吸作用,这与苹果[5]和茶[8]的无糖组培生根研究结果相一致。

研究表明,提高培养容器内气体交换频率,可以改善马铃薯[26]和桉树[27]的气孔功能,提高其存活率与生根率,有利于不定根的形成和发育[11]。在本试验中,猕猴桃无糖组培生根过程中,CO2富集和强制换气组合的生根效果显著好于自然换气。可能由于强制换气改善了内部气体环境,影响了组培苗生理代谢从而诱导不定根快速表达。因品种基因型不同,‘郁香’和‘脐红’组培苗对于CO2浓度和强制换气时间的适应存在一定差异。

POD被认为与不定根的形成发育密切相关[28]。本研究中,无糖组培条件下‘郁香’和‘脐红’分别在根系快速产生的第7天和第14天时,POD活性达到高峰且显著高于对照(图1-A、图1-B,图2),说明无糖组培诱导猕猴桃茎尖快速生根可能与此时POD活性较高有关[29],而POD活性峰值出现时间有所差异可能与品种有关。PPO能催化酚类物质且与IAA形成一种生根辅助因子“IAA-酚酸复合物”[30]。无糖组培条件下,‘郁香’和‘脐红’的PPO活性分别在第1天和第4天时最高[7.33和10.09 U/(g·min)],因而PPO可能参与诱导培养初期猕猴桃茎尖不定根的形成[31]。在本试验生根培养第7天,无糖组培条件下的‘脐红’和‘郁香’IAAO活性均达到最高峰且显著高于对照(图2),说明IAAO活性的增强利于不定根形成。此后IAAO活性一直保持较低水平,这与前人研究的生根后期IAAO活性降低促进不定根快速伸长的结果相一致[30,32]。

研究表明,相比传统有糖组培,植物在无糖组培条件下会产生更多的内源激素[7]。研究发现,千年桐、月季、纳塔栎进行嫩枝扦插时,生根中期IAA含量快速下降,待不定根伸长时其含量缓慢增加,并逐步接近扦插初期水平,这与本试验的IAA变化规律高度一致,说明生根前期较高浓度的IAA能够促进根原基形成,后期高浓度IAA促进不定根的伸长。ABA可促进细胞分裂或与其他激素相互作用,从而刺激某些植物插穗生根[33-35]。周幼成[36]研究发现,ABA能够诱导气孔关闭,降低蒸腾作用从而减少水分流失。在无糖组培第7天增加了强制换气的流量,‘脐红’和‘郁香’为更好保护自身,利用ABA调节气孔关闭,这解释了ABA含量激增的缘故。同时内源ABA含量的增加,可以提高根系的吸水性和溢泌速率,促进蛋白质合成,增加根冠比[37]。研究发现,内源GA3对无性繁育中不定根的形成因物种而异[38]。在本试验中,培养至第7天后GA3含量逐步上升,且无糖组培的GA3含量显著高于有糖组培,推测高浓度的GA3可能有利于不定根的快速伸长以及次级根的形成。

综上所述,无糖组培能显著改善猕猴桃无性繁殖的生根效率,提高生根质量。在无糖组培生根过程中内源激素和相关酶活性变化复杂,且共同参与生根机制。本研究建立的新型无糖组培诱导茎尖快速生根技术,为猕猴桃种苗工厂化快速繁育奠定了理论基础。