基于线粒体 Cytb 基因和D-loop区的鸭绿江流域细鳞鱼群体遗传多样性

王丹丹,宋 洁,王 旭,乐海梅

(辽东学院 鸭绿江流域研究院,辽宁丹东 118000)

细鳞鱼(BrachymystaxlenokPallas)又称细鳞鲑,是中国名贵的鲑科冷水经济鱼类,隶属于鲑形目(Salmoniformes)鲑科(Salmonidae)细鳞鱼属(Brachymystax)。生长速度快,肉质细嫩,脂肪含量高,无肌间刺,营养价值较高;主要分布于中国东北的黑龙江、鸭绿江、牡丹江、松花江、嫩江及其支流等。近年来,由于渔业资源过度开发利用、环境污染、外来鱼种引入以及河流水量减少等因素,使细鳞鱼自然繁殖受到影响而数量锐减,1998年,细鳞鱼被列入《中国濒危动物红皮书》,为国家二级重点保护水生野生动物[1]。当生存压力超出细鳞鱼生长发育的可塑范围时,只有尽可能保护其遗传多样性,建立具有一定数量可利用的遗传多样性数据库,才有可能改变细鳞鱼的濒危状态[2-3]。所以,掌握细鳞鱼遗传多样性与选育优良品种是减少其野生资源过度开发,实现细鳞鱼资源可持续利用与长期保护的有效途径。

线粒体为真核细胞中双层膜棒状或粒状的半自主性细胞器﹐为能量产生的主要场所。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)基因组为共价闭合双链环状DNA,具母系遗传、结构简单稳定、基本不发生重组、变异率高、进化速度快以及多态性高等特点,是研究群体遗传变异与遗传结构、系统进化和动物保护生物学的重要分子标记[4]。动物mtDNA由编码区和非编码区组成,细胞色素b基因(Cytochrome b,Cytb)位于编码区,进化速度适中,在mtDNA 的13个蛋白质编码基因中其结构和功能较保守,富含种内或种间甚至科属间的遗传进化信息,适用于种间和种内遗传结构及遗传多样性的研究[5];D-loop 区为mtDNA控制区,位于非编码区,因缺乏编码的自然选择压力而进化速率快于其他线粒体基因,串联重复序列较多,碱基变异率高于编码区,富含系统发育信息,可根据非编码区的序列差异对亲缘关系较近的物种种内或种间进行系统进化关系和遗传多样性研究[6]。刘伟等[7]基于线粒体 D-loop区和Cytb基因序列对四川裂腹鱼养殖群体进行遗传多样性研究;李大命等[8]基于线粒体Cytb基因和D-loop区序列对高邮湖湖鲚进行遗传多样性分析;Zhao等[9]采用线粒体Cytb基因和D-1oop区对河西走廊流域的祁连山裸鲤进行群体遗传结构分析;代应贵等[10]为保护四川裂腹鱼乌江种群及其遗传多样性而基于mtDNA D-loop区对四川裂腹鱼乌江种群进行遗传多样性分析;郭丹丹等[11]基于线粒体Cytb基因和 D-loop区对舟山野生与养殖小黄鱼群体遗传多样性进行研究;麻智芳等[12]基于mtDNA D-Loop区和Cytb基因对清水江斑鳜群体遗传多样性进行了分析;余科等[13]基于Cytb和D-Loop基因对中国少鳞鳜种群遗传多样性的进行分析。可见,Cytb基因和 D-loop区已成为鱼类系统进化、群体遗传结构与遗传多样性研究中重要的分子标记技术。

目前,由于细鳞鱼物种的保护愈发被重视,细鳞鱼遗传多样性研究成为热点。专家分别采用不同标记技术对中国不同海域细鳞鱼的遗传结构进行了分析,但成果较少,王荻等[14]采用AFLP对牡丹江、鸭绿江和乌苏里江的3个细鳞鱼野生种群进行遗传多样性分析;闫春梅等[15]采用微卫星分子标记技术对中国东北部山区细鳞鱼4个群体遗传多样性分析进行了调查研究。目前,对鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼野生群体遗传多样性,以及野生群体和养殖群体遗传多样性的比较分析尚未见报道。因此,本研究基于线粒体Cytb基因和 D-loop 区序列对鸭绿江流域(丹东段)2个野生群体,即宽甸(KD)和丹东市(DD),和1个养殖群体(YZ)进行遗传结构、遗传多样性及其亲缘关系比较研究,不但从分子水平上可丰富中国鸭绿江流域细鳞鱼群体遗传多样性数据库资源,而且对细鳞鱼种质资源保护、遗传育种、健康养殖以及合理开发利用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以细鳞鱼为试验材料,野生群体分别采集于鸭绿江流域宽甸(KD)和丹东市(DD)2个不同地域,从当地渔民或者垂钓者收购细鳞鱼;1个人工养殖群体(YZ)采于丹东细鳞鱼养殖基地,每个群体随机采集30尾,剪取细鳞鱼新鲜鳍条组织置于液氮中固定保存。

1.2 Cytb 基因与D-loop区序列克隆与测序

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.3 Cytb 基因与D-loop区序列数据处理

将测序后的Cytb基因和D-loop区序列采用DNA Star 5.0软件中的Edit Seq读取,以SeqMan进行序列拼接、编辑, DNAMAN 8.0和Clustal X 1.83对获得的细鳞鱼Cytb基因和 D-loop区序列进行多重比较、截取同源序列,并人工校对保留有效片段、确保准确性。采用BioEdit 7.0统计校正后的3个细鳞鱼群体Cytb基因和 D-loop区序列4种碱基组成,采用MEGA 7.0邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建3个细鳞鱼群体单倍型间的系统进化树(1 000次抽样,Bootstraps检验进化树置信度),以Kimura-2-parameter模型计算遗传距离[18]。利用Arlequin 3.5进行差异性分子方差显著性检验(AMOVA),计算群体间遗传分化指数(F-statistics,Fst)。利用DNA SP 6.0对3个细鳞鱼群体的Cytb和D-loop序列进行单倍型和遗传多样性分析,运算分析样本的多态位点数(S)、单倍型数(H)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)、平均核苷酸差异数(K)、Tajima’sD、Fu and Li’sF和基因流(Nm)等参数,统计单倍型在3个细鳞鱼群体中的分布[19]。

2 结果与分析

2.1 细鳞鱼线粒体 Cytb 基因和 D-Loop区碱基组成

经基因克隆、测序、拼接以及多重比对,最终获得3个群体90尾细鳞鱼个体的Cytb基因和D-loop区同源序列。结果表明(表2):Cytb基因同源序列长度为1 141 bp,其中A、T、G、C 4种碱基所占比值分别为24.8%、28.75% 、15.25%和31.20%,A+T含量53.55%,G+C含量 46.45%,Cytb基因密码子第1位上4种碱基出现频率差异较小,第2位上出现明显偏倚,T(40%)而G(13.9%),第3位C(41.3%)和A(31.1%)出现频率明显高于T(22.9%)和G (4.7%);D-loop区序列通过比对获得的同源序列长度988 bp,其中A、T、G、C,4种碱基所占比值分别为31.98%、30.77% 、14.27%和 22.98%,其中A+T含量62.75%,G+C含量 37.25%,D-loop区序列密码子表现出明显的偏倚性,密码子3个位点中A、T和C的频率明显高于G;可见,Cytb基因和D-loop区同源序列碱基平均含量A+T均高于G+C,D-loop区序列比Cytb基因更具碱基偏倚性,与硬骨鱼类线粒体基因的碱基组成相一致。

表2 Cytb 基因与D-loop序列碱基组成Table 2 Base composition of Cytb gene and D-loop sequence

2.2 细鳞鱼群体遗传多样性分析

3个细鳞鱼群体基于Cytb基因共确定42个多态位点(S),21种单倍型(H),单倍型多样性(Hd)0.986,核苷酸多样性(Pi)0.004 66以及平均核苷酸差异数(K)4.828。其中细鳞鱼养殖与野生群体相较,YZ群体S(11)、H(6)、Hd(0.807)、Pi(0.002 53)和K(4.020)均低于KD群体(S=19,H= 14,Hd=0.991,Pi=0.004 21,K= 4.941)和 DD群体(S=12,H= 10,Hd= 0.987,Pi=0.003 08,K= 5.211);而两个野生群体中,KD群体S、H、Hd、Pi与K数据均高于DD群体(表1、表2)。D-loop区共确定56个多态位点(S),26种单倍型(H),单倍型多样性(Hd) 0.981,核苷酸多样性(Pi)0.019 82以及平均核苷酸差异数(K)7.690。其中细鳞鱼养殖与野生群体相较,YZ群体S(13)、H(10)、Hd(0.843)、Pi(0.010 26)和K(7.690)同样均低于KD群体(S=24,H= 16,Hd=0.998,Pi= 0.020 17,K= 7.861)和 DD群体(S=19,H=15,Hd=0.991,Pi=0.018 95,K= 7.494);而两个野生群体中,KD群体S、H、Hd、Pi与K数据同样均高于DD群体(表3、表4)。综上所述,3个细鳞鱼群体为单倍型多样性较高的群体(Hd> 0.5),其中养殖群体的遗传多样性较野生群体略低,而KD群体遗传多样性最高,DD群体次之。可见,鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼群体遗传多样性总体表现出较高的单倍型多样性和核苷酸多样性的模式(Hd>0.5,Pi> 0.005),表明该地域细鳞鱼群体的多样性程度较高,即KD>DD>YZ。

表3 3个细鳞鱼群体 Cytb 基因与D-loop序列群体遗传多样性参数Table 3 Genetic diversity parameters in mtDNA Cytb gene and D-loop region sequence of three populations of B.lenok

表4 Cytb 基因与D-loop区单倍型的群体分布Table 4 Population distribution of Cytb gene and D-loop sequence haplotypes

2.3 细鳞鱼群体中性检验

中性检验是检测物种群体历史动态扩增事件的一种较为准确的方法(图1)。基于3个细鳞鱼群体的线粒体Cytb基因和D-loop区序列中性检验的Tajima’sD值和Fu and Li’sF值均为负数(P<0.05),KD和DD群体Cytb基因中性检验的Tajima’sD值和Fu and Li’sF值显著偏离中性(P<0.05);核苷酸不配对分析显示,基于细鳞鱼线粒体Cytb基因KD群体呈现单峰模式,检测出群体扩张,而DD 和YZ群体则呈现多峰模式,表明可能未出现群体扩张现象;而基于D-loop区序列3个细鳞鱼群体均呈现多峰模式,并未出现单峰“泊松分布”,符合中性进化的假设,未检测到群体扩张。综上所述,鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼KD和DD群体可能经历过群体扩张事件,随后处于相对平衡稳定状态。

图1 3个细鳞鱼群体 Cytb 基因和D-loop区序列核苷酸错配分析Fig.1 Nucleotide mismatch analysis of Cytb and D-loop of three populations of B.lenok

2.4 细鳞鱼群体遗传分化

基于细鳞鱼3个群体间Cytb基因序列获得的遗传距离(表5,表6)显示, KD、DD和YZ细鳞鱼群体内遗传距离为0.005 3～0.008 2,差异较小; 3个细鳞鱼群体KD和DD、KD和YZ、DD和YZ遗传距离分别为0.006 7、0.005 8和 0.006 1;细鳞鱼KD和DD,KD和YZ,DD和 YZ群体间遗传分化指数(Fst)分别为0.012 11, 0.063 39和0.078 78,其中KD和YZ,DD和 YZ遗传分化指数大于0.25,表明群体间分化达到极显著水平 (P<0.001);细鳞鱼KD和DD,KD和YZ,DD和 YZ群体间基因流(Nm)分别为 1.341,0.197和0.301(表7);3个细鳞鱼KD,DD和YZ群体内基于D-loop区序列的遗传距离为0.011 8～ 0.014 7,差异较小;群体间KD和DD,KD和YZ,DD和YZ遗传距离分别为0.016 1,0.015 6和 0.014 7;KD和DD,KD和YZ,DD和 YZ群体间Fst分别为-0.001 99,0.090 12, 0.053 67,KD和YZ,DD和 YZ群体间遗传分化指数大于 0.25,表明群体间分化达到极显著水平(P< 0.001);细鳞鱼KD和DD,KD和YZ,DD和 YZ群体间基因流分别为0.975,0.356和 0.255,可见野生与养殖群体间基因交流较弱。AMOVA结果分析显示,基于Cytb基因群体间变异为整体变异的26.62% ,群体内变异占 73.38%(表8);基于细鳞鱼D-loop 区序列,群体间变异占整个变异的14.09%,群体内变异占整个变异的 85.91%。综上所述,细鳞鱼3个群体的遗传变异几乎全部来源于群体内。

表5 群体遗传分化与遗传距离Table 5 Population genetic differentiation and genetic distances

表6 群体内遗传距离Table 6 Population genetic differentiation and genetic distances

表7 细鳞鱼群体间基因流Table 7 The gene flow among Brachymystax lenok populations

表8 分子方差分析(AMOVA)Table 8 Analysis of molecular variances(AMOVA)

2.5 细鳞鱼单倍型系统发育树

采用Mega 7.0邻接法(Neighbor-Joining,NJ)分别基于3个细鳞鱼群体的Cytb基因和D-loop区单倍型构建系统发育树(图2)。结果表明,3个细鳞鱼KD、DD及YZ群体均未呈现较显著的地理聚集且群体间单倍型相互交叉。基于Cytb基因的21个单倍型中,Hap1、Hap3、Hap8、Hap11、Hap14和Hap15为优势单倍型,3个群体均具3个单倍型Hap5、Hap11和Hap14,7个为KD群体特有单倍型Hap2、Hap4、Hap10、Hap12、Hap13、Hap17、Hap18,3个为DD群体特有单倍型Hap8、Hap9和Hap19,3个为YZ群体特有单倍型Hap6、Hap7和Hap21,KD和DD群体具有4个相同单倍型Hapl、Hap3、Hap15和Hap16。基于D-loop区序列的26个单倍型中,Hap2、Hap13、Hap15、Hap21和Hap24为优势单倍型,3个群体均具2个单倍型Hap21和Hap24,4个为KD群体特有单倍型Hap1、Hap12和Hap19、Hap20,4个为DD群体特有单倍型Hap6、Hap7、Hap9、Hap10,3个为YZ群体特有单倍型Hap14、Hap16和Hap25,KD和DD群体具有8个相同单倍型Hap2、Hap4、Hap8、Hap 11、Hap13、Hap22、Hap23,KD和YZ群体具有2个相同单倍型Ha15和Hap26,DD和YZ群体具有2个相同单倍型Ha5和Hap17。

图2 基于 Cytb 基因单倍型序列的细鳞鱼群体系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on haplotype sequences of Cytb gene and D-loop region sequence of Brachymystax lenok

3 讨 论

3.1 遗传多样性

遗传多样性,又称基因多样性,是指生物群体间和群体内遗传变异的总和,是物种进化以及评判物种对生存环境适应能力、生存能力以及进化潜力的依据。遗传多样性水平较低会造成物种衰退或濒临灭绝,反之,能够为物种进化提供充足的潜力,以保证物种的持续发展。单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)是衡量群体遗传多样性的重要指标,根据Was等[20]Hd为0.5和Pi为0.005为临界标准,二者数值越大反映生物群体的遗传多样性越高。鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼群体mtDNACytb基因和D-Loop区的Hd和Pi分别为0.986、0.981和0.004 66、0.019 82,可见Cytb基因为高Hd和低Pi,而D-Loop区属高Hd和低Pi,说明鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼群体是一个大而稳定的群体,经历长时间的生物演化而积累了丰富的遗传多样性。纵观整体,细鳞鱼D-Loop区遗传多样性明显高于Cytb基因,该差异可能是由于D-loop区位于非编码区,因缺乏编码的自然选择压力而较Cytb等其他线粒体基因的进化速率更快,所以,关于细鳞鱼群体遗传多样性分析,D-loop区序列的灵敏度远高于Cytb基因,但同时D-loop区序列的变异速率要低于Cytb基因,如郭丹丹等[11]对90尾小黄鱼的3个群体进行遗传多样性研究中,Cytb基因的Hd(0.980)>D-Loop 区(0.978)。综上所述,由于细鳞鱼mtDNA进化速率随区域不同而具有差异,所以采用细鳞鱼mtDNA不同区域分析遗传多样性存在差异性。此外,基于细鳞鱼群体Cytb基因和 D-loop区序列分析发现,YZ群体的Hd和Pi略低于KD和DD群体,且KD和DD 2个野生群体比较,KD群体的Hd和Pi高于DD群体,可见细鳞鱼野生群体的多样性略高于养殖群体,遗传多样性KD>DD>YZ,该结果与大獭蛤[21]的研究结果一致。

3.2 遗传分化

常用遗传距离、基因流和遗传分化指数衡量群体间的遗传分化程度。细鳞鱼群体基于Cytb基因获得群体间遗传距离KD和DD为0.006 7,KD和YZ为0.005 8,DD和YZ为0.006 1,基于D-loop区序列获得的群体间遗传距离KD和DD为0.016 1,KD和YZ为0.015 6,DD和YZ为0.014 7;基于D-loop区序列分析KD、DD 和YZ群体内遗传距离(分别为0.012 6、0.014 7和 0.011 8)远大于基于Cytb基因获得的遗传距离 (0.008 2、0.007 6和0.005 3),可能是由于细鳞鱼群体mtDNA 的Cytb基因和D-Loop区序列进化速度不同而导致变异的差异性,但细鳞鱼无论群体间或群体内的遗传距离均十分相近,且远低于2%的群体间遗传分化界限,说明鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼群体并未发生明显的遗传分化现象。遗传分化指数为0～0.05,表示群体间遗传分化极小;0.05～0.15,表示群体间遗传分化中度;0.15～0.25,表示群体间遗传分化较高。本试验中基于Cytb基因和D-Loop区序列,KD和DD群体间遗传分化指数均小于0.05,说明细鳞鱼两个野生群体间遗传分化程度非常小,而KD和YZ、DD和YZ细鳞鱼群体间遗传分化指数均为0.05～0.15,说明鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼养殖群体与野生群体间遗传分化程度为中度,且该流域的细鳞鱼野生群体间存在较为频繁的基因交流,表明KD和DD区域修建水力发电站尚未对细鳞鱼种质资源交流产生显著影响,但野生群体与养殖群体间基因交流甚少,与厚壳贻[22]的研究结果一致。AMOVA分析发现,群体内变异是鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼遗传变异的主要来源。系统进化分析方面,由细鳞鱼Cytb基因和 D-loop区的单倍型构建系统发育树表明3个细鳞鱼群体间的单倍型并未表现出明显的地理聚集并且相互有交叉,充分说明该地域的3个细鳞鱼群体间遗传分化尚不显著,与遗传分化研究结果一致,且与李珊[23]的清水江斑鳜群体遗传多样性分析的结论一致。

3.3 群体历史动态

群体历史动态分析方面,核苷酸不配对分析和Tajima’sD和Fu and Li’sF中性检验是判断生物群体是否发生过种群扩张较为准确的种群动态检测方法。其中当核苷酸不配对分布曲线呈明显的单峰形“泊松分布”时,表明群体历史有可能经历过扩张,而Tajima’sD和Fu and Li’sF二者数值为负且具有显著差异时,亦说明群体经历过群体扩张。本研究核苷酸不配对分析显示,基于细鳞鱼线粒体Cytb基因KD群体呈单峰模式,检测出群体扩张的情况,而DD 和YZ群体则呈现多峰模式,表明可能未出现群体扩张现象;而基于D-loop区序列3个细鳞鱼群体均呈现多峰模式,并未出现单峰“泊松分布”,符合中性进化的假设,未检测到群体扩张;线粒体Cytb基因和 D-loop区序列中性检验的Tajima’sD值和Fu and Li’sF值均为负(P<0.05),其中KD和DD群体Cytb基因中性检验的Tajima’sD值和Fu and Li’sF值显著偏离中性(P<0.05)。综上所述,鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼KD和DD群体可能经历过群体扩张事件,随后处于相对平衡稳定状态,与乔氏新银鱼[24]、河髻[25]和大银鱼[26]的研究结果一致。

4 结 论

鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼群体遗传多样性较高,虽朝着不同谱系进化,但3个群体分化不明显,尚未形成显著的地理聚集格局。细鳞鱼野生群体间的遗传分化程度略低,经过长期的人为驯化,细鳞鱼的养殖群体和野生群体间遗传分化中度水平。高Hd和高Pi表明一个大而稳定的群体经过长时间演化所产生或是两个不同系群的群体二次接触,Hd和Pi的变异均低,意味着最近发生过种群的瓶颈效应或由单一、少数种群所产生的建立者效应;高Hd而低Pi,预示着群体曾经历过瓶颈效应后,伴随迅速的种群扩张与变异积累。本研究中鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼群体遗传多样性总体表现出较高的单倍型多样性和核苷酸多样性的模式(Hd>0.5,Pi>0.005),表明该流域细鳞鱼群体的多样性程度较高,但养殖群体的遗传多样性低于野生群体,可能是由于细鳞鱼养殖群体近期发生了瓶颈效应,所以,这就要求在细鳞鱼选育过程中及时补充不同群体或野生群体的优良性状,杜绝近亲繁殖以及瓶颈效应等,保持细鳞鱼选育群体的遗传多样性。此外,鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼群体单倍型组成呈现不均匀现象,其中细鳞鱼优势单倍型个体适应环境能力较强且拥有较大的繁殖群体,而低频率单倍型因其适应环境能力较差而导致繁殖群体较小,较容易对整个鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼种群的遗传多样性造成负面影响。因此,未来仍需持续加强对细鳞鱼种质资源保护,通过限制人为捕捞、改善江水生态环境、加强细鳞鱼资源动态变化监测等措施增加鸭绿江流域(丹东段)细鳞鱼资源量和遗传多样性水平,改善细鳞鱼遗传结构,为该流域细鳞鱼的遗传育种和持续发展做出贡献。