基于网络药理学及分子对接探讨癃清片治疗慢性前列腺炎的作用机制

金 悦 ,程义东 ,王安喜

(南京中医药大学附属南京市中医院,江苏 南京 210000)

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis,CP)是男性常见疾病之一,多表现为下腹及会阴部疼痛、排尿及性功能异常,发病率高,病程长,在一定程度上影响患者的生活与精神状态。流行病学显示,我国有8.4%的男性患有前列腺炎症状,其中CP是最常见的类型[1]。除应用α受体阻滞剂、5-α还原酶抑制剂外[2-3],祖国医学也展现出了独特优势。癃清片作为临床上治疗CP的常用药物,在改善患者的疼痛及异常症状上疗效较好。癃清片是以泽泻、车前子、败酱草、金银花、牡丹皮、白花蛇舌草、赤芍、仙鹤草、黄连、黄柏十味中药构成的复方,能够清热凉血、解毒通淋,适用于CP。动物实验表明癃清片不仅具有良好的局部及中枢镇痛效果,还能抑制小鼠体内的炎症因子[4]。多项临床应用也表明癃清片能改善CP患者临床症状,提高患者生活质量,减轻患者精神压力[5-6]。癃清片治疗CP的具体机制尚未明确,本文拟通过网络药理学及分子对接对癃清片治疗CP的潜在靶点进行预测,探讨治疗CP的作用机制,为未来相关研究及临床应用带来新视野。

1 材料与方法

1.1 癃清片中药物活性成分及作用靶点

通过TCMSP数据库[7],分别以癃清片中单味药物为关键词,以口服利用度(OB)≥30%及药物相似性(DL)≥0.18为标准,筛选出药物的活性成分及与之对应的潜在靶点,剔除重复数据后整理得到癃清片的潜在靶点。在UniProt数据库中选择“Reviewed”“Human”下载人类基因官方靶点名称。利用R软件进行匹配。

1.2 CP靶点的获取

在GeneCards数据库中以“Chronic prostatitis”为关键词,检索相应靶点。利用Perl脚本及R软件,将获取的癃清片药物靶点与疾病靶点选取其中交集部分,得到Drug-Disease潜在靶点及官方基因名称,绘制相应Veen图。

1.3 构建PPI网络

将潜在靶点导入STING数据库,Organisms选择“Homo sapiens”,最低互动得分设置为0.9,去除游离节点,构建相应PPI网络。将潜在靶点的相互作用通过Cytosacpe软件下载CytoNCA进行拓扑分析及可视化分析。

1.4 构建疾病-药物-成分-靶点网络图

将Drug-Disease文件导入Perl脚本,获取相应的作用关系,再通过Cytoscape软件,构建疾病-药物-成分-靶点网络通路图。

1.5 富集分析

运用R对Drug-Disease进行GO富集分析,选择生物过程(BP)、细胞组分(CC)、分子功能(MF)前10项绘制柱状图,选择KEGG前30条通路绘制柱状图,预测癃清片治疗CP的潜在作用机制。

1.6 分子对接

选择排名前10的核心靶点与相应的化合物,使用ChemDraw及Chem3D软件构建3D结构,在PDB网站获取每个靶点所对接靶蛋白及配体结构,通过AutoDock Tools、AutoDock Vina[8]进行分子对接,PyMoL软件进行数据处理与可视化分析。

2 结果

2.1 癃清片中药物活性成分及作用靶点

在TCMSP数据库中,对癃清片中中药筛选后共得到化合物158种,其中泽泻10种、车前子9种、败酱草13种、金银花23种、牡丹皮11种、白花蛇舌草7种、赤芍29种、仙鹤草5种、黄连14种、黄柏37种,剔除重复成分,筛选出有效活性成分共118种。利用R软件与进行人类基因官方靶点名称匹配,剔除重复值后得到药物靶点218个。

2.2 CP靶点的获取

检索到疾病靶点9116个,利用R得到药物与疾病相交集的靶点204个(图1)。

图1 Drug-Disease靶点Veen图

2.3 构建PPI网络

利用STING数据库构建PPI网络(图2)。将STING数据库生成的文件导入Cytosacpe,筛选出33个满足条件的靶点,进行可视化分析(图3)。前10位的核心靶点CTNNB1、ESR1、JUN、AKT1、CAV1、EGFR、IL6、NCOA1、RELA、AR,推测其是癃清片在治疗CP过程中发挥关键作用的靶点。

图2 PPI网络图

图3 以BC和Degree的中位数2倍值筛选出的核心靶点

2.4 构建疾病-药物-成分-靶点网络图

利用Perl脚本及Drug-Disease靶点的相互作用关系,通过Cytoscape构建疾病-药物-成分-靶点网络通路(图4)。网格中共有233个节点及435条边,涉及27种活性成分和204个靶点。

图4 疾病-药物-成分-靶点网络通路图

2.5 富集分析

进行GO富集分析及KEGG通路分析(图5、图6)。GO富集中包括2452个BP、84个CC、197个MF,其中BP与CP相关主要为对活性氧应答、氧化应激反应、脂多糖反应、细胞对氧化应激的应答、对氧含量的应答、神经元凋亡等。CC主要为膜筏、膜微区、质膜小窝、质膜筏、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物等。MF主要为DNA-结合转录因子结合、RNA特异性聚合酶ⅡDNA-结合转录因子结合、核受体活性、配体激活的转录因子活性、G蛋白偶联胺受体活性等。KEGG富集中包含信号通路174条,与CP相关的主要有IL-17 信号通路、C型凝集素受体信号通路、MAPK信号通路、Th17细胞分化、HIF-1 信号通路、细胞凋亡等。

图5 GO富集分析

图7 分子对接可视化分析

2.6 分子对接

除去少量无合适配体的蛋白(CAV1、IL6、RELA)外,各化合物与蛋白对接的最低结合能均<-1.2kcal/mol(表1),说明化合物与相应蛋白能自发结合,最低结合能越小说明结合作用越紧密。利用PyMol软件进行可视化分析(图8),可见关键靶标的氨基酸残基与呈黄色虚线的氢键相互作用。

表1 分子对接结果

4 讨论

CP在祖国传统医学里被称为“精浊”,以盆腔、会阴、阴茎区及下腹部疼痛,排尿或射精时疼痛为主要临床症状[9]。当前临床方案主要改善临床症状及抗感染,长时间、大剂量抗菌药物应用易对人体产生耐药性及不良反应。近年来,癃清片作为安全且有效的治疗药物被广泛应用于CP的治疗。

癃清片治疗CP的主要活性成分为bolusanthol B、β-胡萝卜素(beta-carotene)、槲皮素(quercetin)、高车前素(Dinatin)、Hypolaetin等。槲皮素具有抑制COX-2、巨噬细胞炎症反应的作用,可减少炎症细胞ROS的释放,抑制氧化应激和细胞凋亡[10]。bolusanthol B是来源于败酱草的黄酮类物质,王莉萍等通过提取白花败酱总黄酮,经动物实验后发现其有明显抗氧化作用[11-12]。Hypolaetin是车前子治疗CP的最可能发挥主要作用的化合物之一[13]。高车前素药理活性主要表现在抗炎、抗氧化、神经保护等[14]。

在GO富集分析中,脂多糖可提高血清中炎症因子的含量,导致炎症的发生以及相应部位的疼痛。国外研究表明,大量活性氧(ROS)可通过引发细胞内信号级联反应增强炎性基因表达[15]。氧化应激也是一种重要的病理机制,甚至导致细胞凋亡。也有研究证实免疫功能的强弱与机体的抗氧化水平有关,ROS含量过高会损伤自身免疫功能[16]。在KEGG通路方面,Th17是一种能够分泌IL-17的CD4+T细胞,能够招募及活化各种炎性细胞,诱导炎症反应,与慢性炎症的关系密切[17]。IL-17是重要的炎症介质,不仅能刺激多种炎症因子的产生,还可与其他细胞因子协同作用,进而加剧炎症效应[18,19]。C型凝集素受体信号通路激活不仅可以诱导各种炎症因子和趋化因子的表达,还能促进细胞产生促炎因子[20],MAPK信号通路能够广泛参与细胞的各项增殖、凋亡及应激反应,增加炎症因子的表达[21]。HIF-1α缺氧条件下可大量合成并诱导血管通透因子VEGF的表达,进而促进内皮细胞的活化以诱导炎症[22]。分子对接结果显示蛋白的表达与文献中报道的趋势基本一致,癃清片治疗CP是由于多成分、多靶点、多通路之间的复杂作用。

癃清片主要通过调节多种核心靶点,对活性氧应答、氧化应激反应等生物学过程及IL-17、MAPK、C型凝集素受体等信号通路治疗CP。本文以网络药理学与分子对接为基础,通过大量数据与文献提升了对于疾病的认识,初步揭示了癃清片治疗CP的作用机制,对今后疾病的诊治提供了新的指导,但也存在一定的局限性。首先,由于部分靶点蛋白未能匹配相应配体,后续需针对相关成分及靶点蛋白进行进一步测试;其次,癃清片进入人体后吸收及代谢存在差异,囿于客观条件及时间限制,未能结合试验完成进一步验证;最后,本文选取癃清片的主要成分及靶点,可能未涵盖癃清片中10味中药的全部有效活性成分,在今后的研究中仍可进一步探讨。