基于网络药理学和分子对接研究表热清颗粒治疗呼吸道感染的分子机制

宋玉莹,任 睿,罗红艳,李海舟*

(1.昆明理工大学生命科学与技术学院,云南 昆明 650500;2. 云南雷允上理想药业有限公司,云南 昆明 650000)

致病微生物入侵呼吸道并繁殖导致呼吸道感染的发生,主要症状为发热、咳嗽、咯痰等,且由于急性呼吸道感染病情进展较快,若不及时进行治疗则容易导致肺炎的发生[1]。因此临床一般采用抗炎退热、止咳化痰、抗病毒、抗细菌、营养支持等治疗呼吸道感染[2]。虽然抗生素的应用能有效治疗细菌性呼吸道感染,但对于病毒性感染效果不佳。而中医认为本病因外邪入侵脏腑,邪气上升,肺胃郁热导致。表热清颗粒作为一种中成药,系云南省临床应用40余年之傣医处方,用于治疗感冒发热、急性咽炎、急性支气管炎、单纯性肺炎、腮腺炎等病症,该方在抗炎退热方面,疗效显著。该方以傣医药特色药材柘树根(具有清火泻毒退热功效)为主,组方增加进的柴胡,配合以金银花、板蓝根、石膏、甘草等中医常用感冒风热证用药,具解毒退热、解表之功效,临床用于瘟疫时毒、热风毒邪所致病毒性感染症状[3-6]。

Hopkins在2008年提出的网络药理学是运用计算机等技术对多靶点药物进行多层次的网络分析,其基于药物-靶点-疾病之间复杂的网络关系,揭示药物治疗疾病的作用机制,是探索中药生物活性物质和整体分子机制的合适手段[7]。本文基于网络药理学的方法,研究表热清颗粒治疗呼吸道感染的的关键活性成分及其药理作用机制。并通过分子对接方法进行验证,增加结果的准确性。

1 材资料与方法

1.1 筛选表热清颗粒的活性化合物及其潜在靶点

利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集表热清颗粒中七味中药的化学成分和潜在靶点。采用ADME(吸收、分布、代谢和排泄)模型对表热清颗粒的化合物进行筛选,为了筛选出具有良好口服吸收和使用效果的成分,选择筛选口服生物利用度(OB)≥30%,类药物度(DL)≥0.18的化合物。同时,将活性成分导入PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以获取化合物结构。对于每个活性成分,从上述数据库和PubChem的文献中收集其相应的靶点,还在“Homo Sapiens”条件下通过Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测筛选,并利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)对靶点名称进行标准化。

1.2 呼吸道感染的潜在靶点的筛选

在Genecards(https://www.genecards.org/)中使用关键词“呼吸道感染”来搜索与其相关的靶点。此外,表热清颗粒-呼吸道感染共同靶点被R语言相交,并作为表热清颗粒治疗呼吸道感染的潜在靶点。

1.3 蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)构建和关键靶点筛选

在string数据库(http://stringdb.org)中,建立一个由表热清颗粒作用靶点与呼吸道感染作用靶点重叠组成的PPI网络,生物体被设置为“Homo Sapiens”。然后,利用Cytoscape软件中的CytoNCA选项,根据度中心性(degree),中介中心性(Betweenness)和接近中心性(Closeness)对其网络进行富集分析,得到关键靶点的网络关系,选取degree值较高的节点作为PPI网络中假定的关键目标。

1.4 基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)路径丰富分析

通过Metascape数据库(https://metascape.org/)对作用靶点分别进行GO功能与KEGG路径富集分析,以P<0.05为筛选条件,筛选结果用于进一步分析涉及生物学过程、分子功能、细胞成分和功能信号通路的关键靶点。

1.5 网络建设与分析

用Cytoscape软件分析中药-靶点网络,可以对中草药中有效成分和靶点之间的关系有可靠的表示。根据该网络,可以来分析表热清颗粒的关键活性成分。

用Cytoscape软件分析PPI网络。并将string数据库中的数据导入到Cytoscape软件中,绘制并分析表热清颗粒-呼吸道感染共同作用靶点网络。对呼吸道感染治疗的靶点进行筛选,根据degree值、Betweenness值以及Closeness值三个参数筛选后,得到关键靶点。

为了对药物中有效成分,共同作用靶点和KEGG通路之间的关系有可靠的表示,用Cytoscape软件对药材-成分-靶点-通路网络进行分析。根据该网络,可以利用三个参数来筛选出表热清颗粒的关键活性成分和表热清颗粒治疗呼吸道感染的关键药理机制。

1.6 分子对接

在PubChem数据库,得到关键活性成分,在ChemBio 3d进行能量最小化,保存为SDF格式文件;并运用Pymol软件将化合物转化为pdb文件格式。使用蛋白质数据库(pdb, http://www.rcsb.org/)收集核心目标的晶体结构。

使用AutoDock工具(http://mgltools.scripps.edu/)进一步用于去除水和将氢原子添加到核心靶的晶体结构中,并保存为PDPQT格式。利用AutoDock实现关键活性成分与核心靶标之间的分子对接。最后,选择结合能绝对值最高的结合模式进行深入分析。使用PYMOL软件将分子对接结果可视化为3D图。

2 结果

2.1 表热清颗粒的活性化合物及其潜在靶点

从TCMSP和文献中进行搜索,汇总去重,并且由于表热清颗粒主要由口服给药,故选择ADME参数中的OB≥30%和DL≥0.18对成分进行初筛。结合文献参考,最后得到172个主要成分,其所含化学成分数量如下:柘树根4个、金银花29个、板蓝根43个、石膏1个柴胡18个、黄芩38个,甘草39个。对这些主要成分进行靶点预测发现277个的作用靶点。构建药材-化合物-作用靶点网络,进一步阐明表热清颗粒有效成分与相应靶点之间的相互作用,如图1所示。基于网络分析,在七种中药材中,对药材-化合物-作用靶点网络图的degree值、Betweenness值以及Closeness值进行筛选,终得到18个潜在活性成分,如表1和图2。

2.2 表热清颗粒对呼吸道感染主要药理靶点筛选

在Genecards数据库中搜索了9977个与呼吸道感染相关的靶基因。为了获得与呼吸道感染相关联的表热清颗粒的作用靶点,对于表热清颗粒与呼吸道感染的靶点使用R语言进行相交,并在图3中显示韦恩图信息。

图3 表热清颗粒靶点-呼吸道感染靶点图

2.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络

对248个共同靶点之间的相互作用进行分析,将共同靶标上传到String数据库中进行蛋白质-蛋白质相互作用网络的绘制,并用Cytoscape软件进行进一步分析,网络如图4所示。使用网络分析仪计算PPI网络的拓扑参数,以确定枢纽节点和关键目标。在图4中,使用节点的大小和颜色来描述目标的拓扑参数。度较大的节点用较大的尺寸描述,度较大的节点用较暗的颜色描述。根据degree,betweennes,closeness数值,筛选后,发现ESR1,PPARG,CTNNB1,IL1B,MYC,TP53,EGFR,AKT1,VEGFA,MMP9,IL6,PTEN,CASP3,HIF1A,TNF,EGF,PTGS2,CCND1,FOS被确定为PPI网络重要靶点。

图4 表热清颗粒与呼吸道感染共有靶点的相互作用图

2.4 GO和KEGG路径富集物分析

将共同的靶点导入Metascape数据库被用于分析GO和KEGG途径富集,以探索表热清颗粒治疗呼吸道感染的作用机制。P≤0.05时,GO和KEGG通路明显丰富。生物过程(BP),细胞组成(CC)和分子功能(MF)是基因本体功能分析的三个组成部分。使用R语言绘制生物过程(BP),细胞组成(CC)和分子功能(MF)各前10个丰富的结果(图5)与KEGG通路的前20个的结果(图6)。

图6 表热清颗粒治疗呼吸道感染的KEGG

2.5 化合物-目标-路径网络的构建

为了进一步探索活性成分,关键靶标和关键通路之间的关系,用Cytoscape建立了一个化合物-靶点-途径网络,对其进行分析简化后得到化合物-靶点-途径网络图(图7)。18个核心化合物分别为Wogonin,Quercetin,1-Methoxyphaseollidin,Glabridin,Licoagrocarpin,Vestitol,Shinpterocarpin,Formononetin,Naringenin,Acacetin,Luteolin,Moslosooflavone,Methyllinolenate,Kaempferol,Baicalein,Stigmasterol,Glyasperins M,Oroxylin a。另外靶标是化合物和途径之间的桥梁。故通过PPI网络和化合物-靶点-通路网络来确定为核心靶标,这意味着它们在PPI网络和化合物-靶点-通路网络中都起着至关重要的作用。最终确定ESR1,PPARG,CTNNB1,IL1B,MYC,TP53,EGFR,AKT1,VEGFA,MMP9,IL6,PTEN,CASP3,HIF1A,TNF,EGF,PTGS2,CCND1,FOS为核心靶点。

图7 化合物-目标-路径网络图

2.6 分子对接

在18个核心化合物和19个核心靶点之间进行对接研究,以验证药物-靶点相互作用的可靠性。这些靶点之所以被选为核心靶点,是因为它们在KEGG途径中起着至关重要的作用,并且也是PPI网络的核心靶点,这意味着这些靶点可能是表热清颗粒治疗呼吸道感染的关键靶点。表2列举了最好的前10个对接结果,如luteolin,baicalein和oroxylin a与MMP9结合,baicalein,wogonin与PPARG结合有较强的相互作用。图8显示了生物活性化合物与核心目标在最低结合能下的对接模式,氢键由一条黄色的虚线表示。结果表明预测的靶标蛋白与化合物有较强结合,可能是表热清颗粒的作用靶点。此外,这些化合物也对新冠病毒直接感染宿主细胞相关的靶标蛋白3CL蛋白水解酶和Rdrp(RNA依赖RNA聚合酶)进行了分子对接,但未发现较强结合物。

表2 分子对接结果

(a)MMP9-luteolin

3 讨论

本研究采用计算机技术,对表热清颗粒治疗呼吸道感染的作用机制和生物活性物质进行研究,以探索表热清颗粒对呼吸道感染的治疗作用。

本研究的药物-化合物-靶点网络分析表明18个主要活性成分,包括Wogonin,Quercetin,1-Methoxyphaseollidin,Glabridin,Licoagrocarpin,Vestitol,Shinpterocarpin,Formononetin,Naringenin,Acacetin,Luteolin,Moslosooflavone,Methyllinolenate,Kaempferol,Baicalein,Stigmasterol,Glyasperins M,Oroxylin a,它们在网络中处于关键作用,是表热清颗粒起作用的关键化合物。其中luteolin可通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶(mito-genactivated protein kinase, p38 MAPK)干预MAPK通路,减轻中性粒细胞的炎症反应[8];quercetin可抑制脂多糖刺激的巨噬细胞、小胶质细胞和肥大细胞产生TNF-α和NO,从而减少炎症反应[9-10];而quercitrin可通过调节线粒体功能、降低过氧化作用来改善细胞活性[11];Kaempferol则能够调节过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性,抑制脂质过氧化作用,抑制炎症反应[12]。有研究证实据报道Baicalein具有改善肾间质纤维化进展中的炎症反应的作用[13],它可以通过抑制MAPK信号通路来阻断肾纤维化期间的上皮-间质转化(EMT)过程,同时抑制巨噬细胞和T淋巴细胞的浸润,以及抑制细胞因子释放TNF-α、IL-1β 和 MCP-1,从而抑制炎症过程,发挥治疗作用[13-15]。Wogonin是一种重要的黄酮类化合物,具有广泛的生物活性,如抗氧化、抗炎、神经保护、抗肿瘤和抗病毒等[16]。Wogonin主要通过抑制iNOS和COX-2的诱导,以及选择性地抑制COX-2来减少NO和前列腺素E2的产生,发挥抗炎活性[17-19]。

PPI网络结果显示,表热清颗粒的靶点涉及MMP9,PPARG,ESR1,CTNNB1,IL1B,MYC,TP53,EGFR,AKT1,VEGFA, IL6,PTEN,CASP3,HIF1A,TNF,EGF,PTGS2,CCND1,FOS等。进一步的GO和KEGG通路富集分析结果显示表热清颗粒发挥作用主要集中在炎症、细胞凋亡、病毒感染等方面,作用于MAPK、PI3K-Akt、IL-17炎症信号通路和Th17免疫细胞分化、细胞凋亡(Apoptosis)等多个信号通路。MMP-9(基质金属蛋白酶9)属于基质金属蛋白酶,能分解呼吸道和肺内的结构复合物如ECM和基底膜,若结合抑制后可缓解对呼吸道细胞外基质的损伤[20]。PPAR-γ(结合过氧化物酶体增殖物)已被报道为先天免疫系统的关键调节因子,表现出中性粒细胞、血小板和巨噬细胞,从促炎介质向抗炎介质的转化[21]。与MAPK1密切相关的MAPK信号通路在DNA损伤、氧化应激及病毒感染中具有关键性作用,在炎症中,TNF-α可诱导MAPK1磷酸化产生炎性趋化因子IL-8,介导中性粒细胞的趋化从而加重机体的炎症反应[22-23]。PI3K-Akt、IL-17等信号通路均参与了炎症应答、调控凋亡过程和氧化还原过程等生物过程。CASP3,TP53在影响RNA病毒的复制以及在治疗肺炎的过程中有重要作用。

4 结论

本研究通过药物-化合物-靶点网络、蛋白质-蛋白质相互作用网络,化合物-靶点-作用通路网络,分子对接技术分析验证,探索表热清颗粒治疗呼吸道感染的多种活性成分和关键药理作用机制。结果表明,表热清颗粒治疗呼吸道感染具有多组分、多靶点、多途径、协同作用的特点。luteolin,baicalein和oroxylin a等为关键活性化合物,以PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路和Apoptosis信号通路为关键分子机制,在抑制炎症因子、调节细胞凋亡、改善氧化应激状态起重要作用。结合作用最强的MMP9靶标若被抑制后可缓解对呼吸道细胞外基质的损伤,并有潜在的抗肿瘤转移活性。研究初步揭示了表热清颗粒治疗病毒性呼吸道感染的关键作用机制,证实对病毒性呼吸道感染所致炎症和细胞以及黏膜损伤有缓解保护作用。

虽然本研究基于现有文献报道从化学成分、活性靶标等方面,提出表热清颗粒对呼吸道感染的关键活性化合物和潜在药理机制,但在需要进一步的体内和体外药理实验验证。