8种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌活性研究

张红艳,韩姗姗,冉淦侨,胡云红,殷 红,张 强

(1.陕西省生物农业研究所,陕西 西安 710043;2.陕西省酶工程技术研究中心,陕西 西安 710043)

随着养殖业规模化、产业化的发展,我国畜禽养殖行业存在着疫病频发、滥用抗生素、养殖环境日趋恶化等诸多问题。我国农业农村部第194号公告明确要求,退出除中药外所有促生长类药物饲料添加剂品种。随着饲料禁抗令的正式出台,以替代抗生素为核心优势与特点,如中草药、生物发酵饲料、益生菌、酶制剂、酸化剂、植物提取物等一大批绿色、健康、安全的无抗饲料添加剂产品受到业界的高度关注。

天然植物中草药具有来源广泛、价格低廉、毒副作用小、无抗药性等优势,可在饲料中长期添加使用。我国《饲料原料目录》收录的中草药包括黄柏、黄芩、苦参、金银花、连翘、板蓝根、鱼腥草、紫苏、蒲公英、柴胡、白芷等清热解毒、抗菌消炎类中药,也包括黄芪、山药、当归、杜仲、甘草、白术、党参、仙茅等补虚扶正、调节阴阳类中药,此外还有神曲、麦芽、谷芽、山楂、大蒜等理气消食、健脾益胃类中药。

中草药富含的黄酮、多糖、苷类、生物碱以及挥发油等活性成分,具有抑菌杀菌、提高畜禽机体免疫力和抗氧化能力,且毒副作用小,在防治动物疾病方面具有十分理想的作用,在一定程度上能代替抗生素的使用。李秀富等[1]探究了复方中药(CCM)对肉仔鸡免疫性能的影响,结果表明:日粮中添加复方中药(CCM)能提高肉鸡的免疫器官指数和新城疫抗体效价,且添加1%CCM的试验组效果最优。刘玉华等[2]选用6种中药对鸡白痢沙门氏菌进行体外抑菌实验,结果发现:鸡白痢沙门氏菌对黄芩、连翘、黄连3种药物高度敏感,对夏枯草中度敏感。曹春雷等[3]研究发现复方中药提取物能显著提高凌云乌鸡的产蛋性能。夏军[4]研究发现饲喂添加60 g/L的复方中药制剂人工乳可治疗猪流行性腹泻。矫松君等[5]研究表明,发酵富锗中药对育肥猪的日粮养分消化率、生长性能和屠宰率均有显著提高。隋鹏飞[6]观察和研究了中药代替抗生素治疗猪气喘病的作用,结果显示采用复合中药治疗的病猪病情控制效果要优于对照组,恢复速度快且精神状态也较好。

中药提取物是目前国际天然医药保健品市场上一种新的产品形态,是采用先进的工艺技术对中药材或中药复方进行提取分离加工得到的一种药效相对明确的中药产品。大量研究表明,中药提取物有效成分有生物碱、多糖、黄酮、皂甙、挥发油和有机酸等,添加在饲料中无毒、无公害、无残留,大多还能促进动物免疫功能提高,表现良好的防病促生长性能,可成为抗生素或激素的替代品[7]。中药提取物有着严格的质量标准,又因其抗菌抗病毒作用强大、易控制、无毒副作用,日益被畜禽养殖领域高度重视。

本研究采用中药提取物组配制成的复方中药液对畜禽常见致病菌∶金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、产气荚膜梭菌进行抑菌研究,对比其抑菌敏感性,为下一步开发畜禽专用无抗生物饲料提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1中药提取物

黄连提取物、薄荷提取物、桔梗提取物、黄芩提取物、蒲公英提取物、金银花提取物、黄柏提取物、栀子提取物、连翘提取物、荆芥提取物、半夏提取物、甘草提取物、当归提取物、杜仲提取物、茯苓提取物、怀牛膝提取物、白头翁提取物、秦皮提取物、野菊花提取物、黄芪提取物、党参提取物(10∶1)、鱼腥草提取物、板蓝根提取物、大蒜提取物、五倍子提取物、大青叶提取物、杏仁提取物,均为10∶1比例提取物,由西安天叶植物原料技术有限公司提供。

1.1.2畜禽4种致病菌

金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26003、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)CMCC(B) 10104、沙门氏菌CMCC(B) 50094、产气荚膜梭菌ATCC 13124,由广州市微生物研究所有限公司保藏提供。

1.1.3培养基

营养肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、营养琼脂培养基、强化梭菌琼脂培养基,购自青岛海博生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1复方中药液的制备

按药方比例分别称取8种复方的中药提取物,充分混合后,按1∶2(W/W)加入纯净水浸泡混匀,超声震荡20～30 min后,4℃静置过夜。次日取出超声震荡10 min后放入45℃保温1 h,7 000 r/min离心8 min,取上清液备用。

1.2.2菌悬液的制备

将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌4种致病菌培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度为1×108～9×108CFU/mL的试验菌悬液。随后将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌的新鲜培养物接种至营养琼脂培养基上,37℃培养18～24 h后做活菌计数;将产气荚膜梭菌的新鲜培养物接种至强化梭菌琼脂培养基上,37℃厌氧培养18～24 h后做活菌计数。

1.2.3中药液抑菌效果测定

采用牛津杯琼脂扩散法测定中药液的抑菌效果。取20 mL温度不超过45℃的琼脂培养基,注入直径90 mm的无菌培养皿中,凝固,制成平板,作为底层。分别接种0.1 mL菌悬液至100 mL温度不超过45℃的琼脂培养基中,摇匀,制成接种菌培养基。在每一底层培养基中加入5 mL接种菌培养基,使在底层上均匀摊布,作为菌层。放置在水平台上冷却后,制成接种菌培养基平板。用镊子将无菌牛津杯均匀地放入接种菌培养基平板上,每块平板等距离放入4只牛津杯。往其中3只牛津杯中分别注入0.25 mL液体样品,同时往第4只牛津杯中注入0.25 mL液体培养基作为空白对照。操作完毕后,将接种金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌的平板平放于37℃的恒温培养箱中培养18～24 h,将接种产气荚膜梭菌的平板平放于37℃的恒温培养箱中厌氧培养18～24 h。培养结束后,测量各个抑菌圈的直径。

2 结果与分析

2.1 8种复方中药液对畜禽常见致病菌的抑菌结果对比

实验中药复方依据中兽药古方、化裁已有成方,由若干种中药提取物组配而成,HLJDS、YQH、BTWS、WWXDY、YJL、QWT、SBZ、PHBQC主要成分详见表1。

表1 8种中药复方的提取物成分

按照1.2.1节的方法制备得到生药浓度为0.5 g/mL的8种复方中药液,对比药液在同一浓度下对畜禽常见致病菌∶金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抑菌结果,详见表2。抑菌结果判定方法按《中药药理学》中的标准判定,抑菌直径达到20 mm及以上的为极敏记为“++++”;15～19 mm为高敏,记为“+++”;10～14 mm为中敏,记为“++”;10 mm及以下为低敏,记为“+”;“-”表示无抑菌作用。

表2 不同复方中药液对畜禽四种致病菌的抑菌结果

由表2可知,8种复方中药液对4种致病菌试验株呈现出不同的抑菌效果。中药液对金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌的抑菌作用要明显优于绿脓杆菌和沙门氏菌。可以看出,HLJDS、YQH、BTWS、WWXDY、QWT、SBZ、PHBQC药液对产气荚膜梭菌试验菌株表现出极敏的抑菌活性,YJL药液对产气荚膜梭菌抑菌活性为高敏;HLJDS药液对金黄色葡萄球菌抑菌活性为极敏,YJL药液对金黄色葡萄球菌试验菌株无抑菌活性,其余6种均对金黄色葡萄球菌表现出中敏抑菌活性;HLJDS对绿脓杆菌试验菌株有一定的抑菌作用,其余7种药液均无抑制作用;除了HLJDS、QWT对沙门氏菌试验菌株有中敏的抑菌活性之外,其余6种均无抑制作用。

从结果上来看,对试验菌株有广泛抑菌作用的是HLJDS,其对4种致病菌均有较好的抑菌效果,其次是QWT,对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌有一定的抑菌作用。HLJDS、QWT平板抑菌圈具体如图1和图2所示。

图1 HLJDS中药液的平板抑菌圈

图2 QWT中药液的平板抑菌圈

2.2 8种复方中药液对单一致病菌的抑菌作用分析

金黄色葡萄球菌作为革兰阳性菌的代表,它可引起动物的皮肤软组织感染、败血症、心内膜炎、肺炎、肠炎等疾病,且易传染,治愈率低,给畜禽养殖造成极大的经济损失[8]。绿脓杆菌,也称铜绿假单胞杆菌,是一种条件性致病菌,常分布于潮湿环境中,也可存在于人和动物的皮肤、呼吸道和肠道等部位,是引起创伤感染最常见的病原,现已有能引起羊化脓性肺炎、鸡急性败血死亡等的报道,严重危害养殖场经济效益[9]。沙门氏菌是人兽共患病原菌,是一种常寄居于人类和动物肠道中的革兰氏阴性胞内兼性厌氧菌,它不仅能够引起畜禽的各种疾病,还能够通过污染的畜禽产品,威胁人类健康[10]。产气荚膜梭菌是一种广泛存在于动物肠道中的革兰氏阳性菌,易引起畜禽坏死性肠炎。当畜禽受到外源性产气荚膜梭菌感染后,产气荚膜梭菌能在肠道快速繁殖,导致组织肿胀坏死,并产生大量可致畜禽死亡的外毒素[11]。8种复方中药液对4种致病菌的抑菌效果详见图3。

图3 不同复方中药液对畜禽主要致病菌的抑菌作用

实验所选致病菌:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌是畜禽养殖上危害较大的致病菌。

由图3可以看出,8种中药液对产气荚膜梭菌的抑菌作用大小依次为:HLJDS>BTWS>WWXDY=SBZ=PHBQC>YQH=QWT>YJL,抑菌直径范围为17～32 mm,均达到高敏以上,其中HLJDS抑菌效果最好,YJL抑菌作用略弱;对金黄色葡萄球菌的抑菌结果为:YQH和YJL没有呈现出抑菌效果,其余6种中药液的抑菌作用大小顺序依次为:HLJDS>WWXDY>BTWS=SBZ>QWT>PHBQC,HLJDS抑菌直径为极敏22.3 mm,抑菌略弱的PHBQC直径为中敏11.0 mm。除此之外,对绿脓杆菌有一定抑菌效果仅有HLJDS,抑菌直径为12.0 mm,对沙门氏菌有一定抑菌效果的是QWT和HLJDS,抑菌直径分别为12.6 mm和12.0 mm。

分析HLJDS的广谱抗菌性跟其主要成分黄芩、黄连、黄柏有关。黄芩、黄连、黄柏是中医临床常用的清热解毒燥湿药,具有清热燥湿、泻火解毒的功效。三者常相互配合,以提高清热解毒的力度,因此被称为三黄。而QWT中的鱼腥草、黄芩、金银花、连翘、板蓝根、甘草具有清热解毒、疏散风热作用,常用作抗病毒、抗炎药物。组方抑菌效果跟提取物的质量、复合比例以及制剂形态也有一定的关系,下一步还将开展中药复方对畜禽常见病毒(鸡新城疫、禽流感、猪腹泻病毒)的抗病毒研究。

3 结论

中草药是一个健康绿色食品、安全可靠、无环境污染的饲料生产营养添加剂,已被人们广泛地关注与研究,在兽医学中具有极高的应用价值和广阔的应用前景[12]。

金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌为畜禽养殖常见致病菌,研究中药提取物构成的中药复方对致病菌的体外抑菌活性具有重要意义。结果显示,8种复方药液对产气荚膜梭菌均表现极敏或高敏的抑菌活性,抑菌直径范围为17～32 mm;HLJDS、WWXDY、BTWS、SBZ、QWT、PHBQS对金黄色葡萄球菌表现出中敏以上的抑菌活性,抑菌直径范围为11～22.3 mm;HLJDS对绿脓杆菌试验菌株有一定的抑菌作用,抑菌直径为12.0 mm;HLJDS、QWT对沙门氏菌试验菌株有中敏的抑菌活性,抑菌直径分别为12.6 mm和12.0 mm。

从抑菌广谱性来说,HLJDS的抑菌效果最好,其对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌均有抑菌活性;其次QWT对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌也有抑菌活性。

中国国家饲料研究所在《21世纪中国饲料工业可持续发展与饲料工业科技》及中国饲料工业协会在《加入WTO对我国饲料工业的影响及对策》中均指出,中国应该大力发展以中药提取物为原料的饲料添加剂、预混料、保健品等。在下一步饲用抗生素替代品的研发中,可根据畜禽具体致病菌来选择需要的中药或者中药提取物复方与益生菌、酶制剂共同研发畜禽无抗饲料添加剂产品。