MTHFR C677T、A1298C 与不明原因习惯性流产的相关性研究

赵 丹，祁 琳，刘 锐，易甜甜，汪红秋，潘 振，谢小芳

(苏州大学附属第二医院精准医学诊断中心，苏州 215004)

习惯性流产(habitual abortion,HA)是指在妊娠前20 周内连续发生了3 次或3 次以上的自然流产[1]。全球1%～3%的育龄女性患有此疾病，属于产科高发疾病。HA 发病涉及因素较多，包括子宫异常、胚胎核型异常、免疫功能紊乱、感染性疾病、内分泌系统疾病、父母遗传疾病(核型异常、隐性疾病携带者、显性疾病和易栓症)等[2-3]。与上述因素无关，且通过宫腔镜，子宫输卵管造影和抗磷脂抗体检测仍无法判断原因的通常称为不明原因习惯性流产(unexplained habitual abortion,UHA)。目前，亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因与UHA 之间是否存在相关性受到了诸多学者的关注。MTHFR 突变易使机体叶酸代谢受阻，降低同型半胱氨酸向蛋氨酸转化从而引起高同型半胱氨酸血症，最终诱发胚胎细胞凋亡导致流产；其遗传多态性已被证实是高同型半胱氨酸的常见遗传因子[4-5]。MTHFR 基因易发生突变，突变概率与突变位点均具有区域性和种族性[6]。目前，暂未发现苏州地区有关育龄女性MTHFR 基因多态性分布与UHA 关系的报道，本研究通过检测患者体内MTHFR 基因C677T以及A1298C 多态性分布，探讨其与UHA 发生的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象与分组 将2021 年1 月—2022 年12 月在苏州大学附属第二医院生殖中心就诊的104例UHA 患者纳入病例组，年龄20～40 岁，平均(29.20±3.40)岁；同期589 名妊娠正常无自然流产史者纳入对照组，年龄20～39 岁，平均(28.58±3.31)岁。两组年龄差异无统计学意义(P＞0.05)。所选受试者的临床资料完整，排除意识障碍、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、生殖系统感染、夫妻双方染色体异常者。

1.2 MTHFR 基因多态性检测方法 选用EDTA 负压抗凝管，采集受试者静脉血2 mL。按照柱式提取试剂盒(苏州康吉诊断有限公司)说明书提取血液样本DNA。使用叶酸代谢能力测定试剂盒(荧光法)(江西诺德医疗器械有限公司)检测C677T、A1298C 基因多态性，ABI7900 PCR 分析仪进行扩增分析，PCR反应体系总体积20 μL，扩增程序：95 ℃10 min 激活荧光基团；95 ℃15 s 变性，60 ℃40 s，40 个循环；室温冷却1 min。60 ℃收集FAM 和HEX(或VIC)通道信号。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件分析基因分布频率。Pearson χ2检验比较两组间基因分布频率，计算OR 值及95%CI；以±s 表示计量资料，组间比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg,H-W)遗传平衡定律校验基因多态性，P＞0.05 表示基因型分布符合H-W 定律。

2 结果

2.1 H-W 平衡检验 H-W 平衡校验结果显示，本研究中MTHFR C677T、A1298C 位点的基因多态性符合该定律(P＞0.05)，见表1，表明所选样本具有群体代表性。

表1 H-W 平衡检验

2.2 MTHFR C677T 基因型及等位基因分布频率差异 病例组与对照组MTHFR C677T 的3 种基因型分布频率(CC、CT 和TT)差异有统计学意义(P＜0.05)，病例组TT 基因型频率及突变T 等位基因频率均高于对照组(均P＜0.05)，见表2。

表2 MTHFR C677T 基因型及等位基因分布频率(n,%)

2.3 MTHFR A1298C 基因型及等位基因分布频率差异 病例组与对照组MTHFR A1298C 3 种基因型分布频率(AA、AC 和CC)以及突变C 等位基因分布频率差异均无统计学意义(均P＞0.05)，见表3。

2.4 MTHFR C677T 基因多态性与UHA 的关系MTHFR C677T 的3 种基因型分布频率(CC、CT、TT)组间两两对比，结果显示，基因型CT 与CC 组间差异有统计学意义(P＜0.05)；基因型TT 与CC 组间差异有统计学意义(P＜0.05)；CT 与TT 组间差异无统计学意义(P＞0.05)。通过Pearson 相关性分析，TT基因型分布频率与UHA 的发生存在显著关联，基因型TT、等位基因T 是UHA 发生的风险因素(OR＞1,P＜0.05)，见表4。

3 讨论

MTHFR 参与体内叶酸和同型半胱氨酸的代谢，与DNA、RNA 和嘌呤的合成密切相关。正常酶活性的MTHFR 有助于维持体内同型半胱氨酸水平，对细胞分裂、胚胎发育和早期妊娠都有重要作用[7-8]。MTHFR基因易突变，基因多态性使酶的不稳定性增加，酶活性下降。常见的多态性是MTHFR C677T(rs1801133)和MTHFR A1298C(rs1801131)。C677T 多态性是核苷酸677 位的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)所取代，导致基因编码的丙氨酸突变为缬氨酸，形成了CC、CT 和TT 3 种基因型，其中677CT 使MTHFR 酶的活性降低35%，677TT 则降低70%[4,9]。A1298C 多态性是1 298处腺嘌呤(A)被胞嘧啶(C)所取代，导致谷氨酸突变为丙氨酸，形成了AA、AC 和CC 3 种基因型，其突变型使酶活性降低程度较C677T 突变弱[10]。研究[11]表明，C677T 突变型CT 与TT，A1298C 突变型AC 与CC 不仅与MTHFR 酶活性减低有关，同时可引起叶酸代谢障碍，血浆叶酸水平显著降低，诱发高同型半胱氨酸血症。而妊娠期血浆总同型半胱氨酸升高可导致孕妇绒毛膜绒毛血管形成缺陷，诱发滋养层细胞凋亡，此外也可诱导血管纤维化，改变凝血途径，增强血小板活化形成血栓，最终导致胎盘梗死和流产的发生[12-13]。目前，MTHFR 基因的多态性已被证实是神经系统疾病和精神疾病/障碍的风险因素，如增加神经管缺陷、唐氏综合征、迟发型阿尔茨海默病[14-15]等的发生。R.R.NAIR 等[16]研究显示，MTHFR C677T 多态性的TT 型使早期HA 发生的风险增加6.30 倍，杂合突变型(CT)使风险增加1.96 倍；其指出MTHFR 677C＞T 多态性可作为北印度人群流产的早期遗传筛查指标。但在埃及女性[17]和日本女性[18]的研究结果中，与对照组相比，病例组的TT 基因型分布频率较高，但差异并无统计学意义。因此，MTHFR 基因多态性与UHA 的相关性仍存在一定的争议。

在本研究中，MTHFR C677T 多态性对照组CC(野生型)基因型分布频率和等位基因C 分布频率均高于病例组，而病例组TT(纯合突变)基因型分布频率明显高于对照组。经Pearson 相关性分析发现MTHFR C677T 位点的等位基因T 与UHA 发病有关，等位基因T(P=0.005,OR=1.532,95%CI: 1.138～2.063)与基因型TT(P=0.005,OR=2.393,95%CI:1.290～4.439)可增加UHA 的发病风险。以上结果表明MTHFR C677T 的突变T 基因可能是UHA 的遗传危险因素之一。这与Y.L.CAO 等[4,19]的研究结果相符。此外，对两组MTHFR A1298C 多态性的分布以及突变的基因频率进行了分析，结果显示病例组AC、CC、等位基因C 与对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)，表明携带MTHFR 1298C 基因与UHA 发生没有显著关联。中国人群MTHFR 基因多态性分布差异大，需根据不同区域，不同基因分布给予个体精准化的治疗。同时，甲硫氨酸还原酶(5-methyltetrahydrofolatehomocysteine methyltransferase reductase,MTRR)基因多态性也是造成叶酸代谢异常，引起自然流产的关键酶之一，今后的研究将结合MTHFR 与MTRR 基因多态性综合分析。

综上所述，MTHFR 677 位点的T 突变可增加UHA 发生的风险，1 298 位点的C 突变与UHA 无明显关联。建议对苏州地区孕龄女性开展常规MTHFR基因多态位点的遗传筛查，在孕早期发现携带MTHFR 677T 基因型，及早干预并制定精准的治疗方案对预防UHA 的发生具有十分重要的临床意义。