自感染性腹泻样品中分离的副溶血性弧菌菌株特征分析

王彧超，许海燕，靳秀秀，张 鑫，黄爱龙

(江苏省南通市疾病预防控制中心微生物检验科，南通 226007)

据报道[1]，食源性疾病的发病率居各类疾病总发病率的第二位。2013 年，江苏省构建起覆盖全省所有行政区域内县级以上医院作为监测医院的食源性疾病监测与溯源系统，以提高食源性疾病患者和食源性疾病事件早期监测能力[2]。副溶血性弧菌是一种常见的食源性致病菌，据估计，我国每年因副溶血性弧菌感染所致的食源性疾病发病高达495.1 万人次[3]。现通过回顾南通市区2018—2022 年食源性疾病系统监测资料，分析3 家哨点医院感染性腹泻患者粪便样品的监测结果，总结副溶血性弧菌的流行情况。

1 材料和方法

1.1 样品来源 选取南通市区哨点医院，采集由食品或怀疑由食品引起的、以腹泻症状为主诉就诊的门、急诊患者粪便样品，同时收集患者的相关信息。诊断标准：选择每日排便次数≥3 次患者的粪便样品，粪便性状异常，如水样便、稀便、黏液便、血便或脓血便等。每份样品采集2～5 g 或2～5 mL，放入Cary-Blair 运送培养基中，室温条件下运送。总共采集样品2 040 份。

1.2 检测试剂与设备 药敏质控菌株ATCC25922及脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)所用的标准菌株H9812 均由江苏省疾病预防控制中心提供。硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS 琼脂)、碱性蛋白胨水增菌液、三糖铁琼脂、营养琼脂等均购自广东环凯微生物科技有限公司，内切酶SfiⅠ购自TAKARA-BIO 公司，Seakem－GoldAgarose 购自LONZA 公司，副溶血弧菌不耐热溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)/耐热直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)/耐热相关溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自赤峰众康生物科技有限公司，BD Phoenix M-50 革兰阴性生化反应及药敏板购自美国BD 公司。所有试剂均在有效期内。BIORAD 脉冲场凝胶电泳系统(型号：CHEF Mapper Power Module)、BIO-RAD 凝胶成像系统(型号：Gel Doc XR+Universal Hood Ⅱ)、BD 全自动细菌鉴定/药敏分析系统(型号：Phoenix M-50)、ABI 核酸扩增仪(型号：7500)性能良好。

1.3 检测方法 根据行业标准WS271-2007 方法对副溶血性弧菌进行检测。

1.3.1 分离鉴定 样品至实验室，取新鲜粪便接种于TCBS 琼脂，37 ℃培养24 h；取粪便0.5 g 接种于10 mL 碱性蛋白胨水增菌液，37 ℃培养6 h 后，挑取增菌液接种于TCBS 琼脂分离培养，37 ℃培养24 h；从琼脂平板上挑取符合副溶血性弧菌反应特征的可疑菌落接种三糖铁琼脂及营养琼脂培养基37 ℃培养24 h；从纯化的琼脂平板上挑取菌落制成0.5 麦氏浓度的菌液，加至BD 公司的革兰阴性生化反应板，将板条放置于全自动细菌生化鉴定/药敏系统BD Phoenix M-50，判读结果。

1.3.2 毒力基因检测 按照副溶血弧菌核酸检测试剂盒说明书要求，对鉴定为副溶血性弧菌的菌株进行TLH、TDH 及TRH 核酸PCR 检测，得到定性结果。

1.3.3 PFGE 分子分型 按照《脉冲场凝胶电泳(PFGE)操作规范》(PulseNet China 管理工作规范)对鉴定为副溶血性弧菌的菌株进行PFGE 实验，得到菌株分子分型，利用Bio Numerics7.6 软件进行聚类分析。

1.3.4 药敏试验 采用BD Phoenix M-50 自动微生物鉴定和药敏分析系统对头孢唑啉(Cefazolin,CFZ)、头孢噻肟(Cefotaxime Sodium,CTX)、头孢他啶(Ceftazidime,CAZ)、头孢西丁(Cefoxitin,CFX)、氨苄西林(Ampicillin,AMP)、氨苄西林/舒巴坦(Ampicillin Sulbactam,AMS)、亚胺培南(Imipenem,IPM)、复方新诺明(Paediatric Compound Sulfamethoxazole Tablets,SXT)、四环素(Tetracyclines,TET)、庆大霉素(Gentamicin,GEN)、氯霉素(chloroamphenicol,CHL)、阿奇霉素(Azithromycin,AZM)、萘啶酸(Nalidixic acid,NAL)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)14 种抗生素进行药敏试验。

1.4 统计学方法 利用WPS Office 2016、SPSS 26.0及Bio Numerics 7.6 对实验结果进行统计和分析。率的比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 副溶血性弧菌检出情况 采集的2 040 份样品中，共检出副溶血性弧菌阳性样品80 份，阳性率为3.92%。女性1 049 例中检出副溶血性弧菌阳性46例，阳性率为4.39%；男性991 例中检出阳性34 例，阳性率为3.43%，不同性别阳性率比较差异无统计学意义(χ2=0.425,P=0.569)。80 例阳性患者中71 例集中发生在8～10 月份，其余9 例散发在其他月份。不同年龄组副溶血性弧菌检出率显示，＞30～40 岁年龄组副溶血性弧菌检出率最高8.82%(42/476)，与其余年龄组[0～10 岁1.18%(1/85)、＞10～20 岁0.65%(1/153)、＞20～30 岁2.97%(16/539)、＞40～50 岁6.48%(12/185)、＞50～60 岁1.36%(4/295)、＞60 岁1.30%(4/307)]比较差异有统计学意义(χ2=11.963,P=0.044)。

2.2 副溶血性弧菌阳性菌株的毒力基因结果 80株副溶血性弧菌的TLH、TDH 及TRH 核酸定性检测显示：73.75%(59/80)的菌株携带毒力基因TLH、TDH，不携带TRH；16.25%(13/80)的菌株携带毒力基因TLH、TRH，不携带TDH；10.0%(8/80)的菌株只携带毒力基因TLH，不携带TDH、TRH。毒力基因型分布集中在TLH+TDH+TRH-型。

2.3 副溶血性弧菌阳性菌株的PFGE 分型和聚类分析 按照PFGE 分子分型的规则，带型完全相同的菌株划分为同一PFGE 型别，除2019180、2022019、2022040 条带降解外(可能与菌株携带某种基因簇有关，已送基因组测序，将持续关注反馈信息)，其余77株分为76 个型别(图1)，总体条带相似度为38.3%，其中2018211 与2018213 判定为100%相似，2019074与2019200、2019154 与2020139、2022138 与2022157、2020125 与2021073、2018150 与2018151、2020168 与2020164、2019199 与2019201、2021101 与2022137之间相似度分别为97.8%、97.6%、97.6%、97.4%、97.3%、95.5%、95.0%、95.0%，同源性极高。

图1 2018—2022 年南通市副溶血性弧菌PFGE 分型聚类分析结果

2.4 副溶血性弧菌的药敏结果 对80 株副溶血性弧菌进行药敏试验，有8 种抗生素的敏感率＞80%，分别为CTX、CAZ、CFX、AMS、IPM、SXT、GEN、CIP；只有CFZ 为100%耐药，其余耐药率均＜40%；对14 种抗生素的耐药主要集中在只对CFZ 这一种抗生素耐药(简称1R)，1R 59 株(73.75%)、2R 17 株(21.25%)、4R 4 株(5.00%)，见表1。

表1 80 株副溶血性弧菌阳性菌株药敏试验结果

2.5 感染性腹泻病例涉及的食品分类、食品加工及包装方式、进食场所分布情况 食源性疾病监测系统2018—2022 年2 040 例病例的监测数据显示，排名前3 位的可疑暴露食品为混合食品(32.16%)、肉与肉制品(20.00%)、水产动物及其制品(19.85%)；可疑暴露食品加工方式以家庭自制(32.99%)和餐饮服务业(27.89%)为主；进食场所主要为家庭(57.99%)、街头食品(11.23%)及饭店(酒店)(8.87%)。副溶血性弧菌阳性病例自述进食的可疑食品主要为水产动物及其制品、混合食品、肉与肉制品，加工方式以餐饮服务业和家庭自制为主，进食场所也是相对应的餐厅和居家为主，见表2。

表2 2018—2022 年可疑暴露食品、可疑暴露食品加工及包装方式、进食场所分布情况(n,%)

3 讨论

2018—2022 年南通市食源性疾病主动监测结果提示：副溶血性弧菌依旧是引起我市食源性疾病的重要细菌性致病因素，检出率为3.92%，与本市2015—2017 年水平相近(4.58%)[4]。本研究显示，副溶血性弧菌阳性病例的分布高峰为8～10 月份，表明夏秋季应是我市感染性腹泻防控的重点季节。各年龄段均易感副溶血性弧菌，检出的80 例中＞20～50 岁有71 例，尤其集中在＞30～40 岁的青壮年，这与副溶血性弧菌7～9 月份高发且以青壮年发病为多的流行特征基本一致[5]。

副溶血性弧菌的TLH 基因是其主要的毒素之一，具有广泛的种属特异性，研究[6]认为副溶血性弧菌无论是临床分离株还是环境分离株均含有TLH基因；TDH 能使人或兔红细胞溶血产生神奈川现象；TRH 具有与TDH 相似的毒性如致死作用和肠毒素作用但却不能溶血。本研究中80 株副溶血性弧菌全部携带TLH 基因，其中TDH 基因阳性59 株(73.75%)，TRH 基因阳性13 株(16.25%)，与南通市2015—2016 年副溶血性弧菌毒力基因携带情况(TLH100%、TDH87.8%、TRH0%)比较[7]，TLH+TDH+TRH-菌株仍占绝大多数，同时这也与国内其他地区临床分离株以携带TDH 基因为多的研究结果[8]类似。副溶血性弧菌中可能还存在与TDH 或TRH 协同作用的其他毒力因子[9]，因此，对于TDH-和TRH-的菌株，仍有致病的可能，正如本研究发现的8 例TLH+TDH-TRH-临床菌株。

PFGE 分子分型可揭示菌株之间的流行病学联系，为疫情溯源提供分子流行病学依据和支持，为建立感染性腹泻的预警提供数据基础。监测发现，南通市副溶血性弧菌的PFGE 带型较多，呈现多样化分布，分析得出76 个型别，无优势型别，提示采集时段内无绝对流行株。其中有2 例菌株为同一型别，经追溯现场流调信息发现，菌株分别来源于同一家庭的2 位感染者，且有共同进食先后发生腹泻的主诉，基本可以认定此2 例感染属同源。另外有8 组菌株的同源性相对较高，达到95%以上，提示可能存在较近亲缘。2019074 和2019200、2019154 和2020139、2022138 和2022157 均曾食用过水产动物及其制品；2018150 和2018151、2019199 和2019201、2020164和2020168 不仅有同日在餐饮行业就餐的情况，且菌株的毒力基因表型一致，进一步印证了存在密切相关菌株的可能性。这些菌株尽管未引起聚集性疫情，但在短时间内高度散发也应引起相关部门的高度重视。PFGE 分子分型虽具有极佳的溯源性，但由于PFGE 分子分型数据库有限和病例的高度散发，加之此次监测仅局限于食源性腹泻病例，未能成功追踪到感染源，此后将扩大食品、水源及外环境监测并对副溶血性弧菌分离株进行PFGE 分子分型，不断拓充菌株来源、扩展数据库，为副溶血性弧菌病疫情预警提供有力的技术支撑。

菌株药敏试验结果显示，80 株副溶血性弧菌的耐药集中在CFZ(100.00%)、TET(36.25%)和AMP(26.25%)，这与多地近年的报道[10-13]一致，除CFZ、AMP、TET、CHL、AZM、NAL 外的其余8 种抗生素的敏感率均＞80%，在副溶血性弧菌感染的治疗中可作为首选抗生素。监测不同来源菌株的耐药情况，其结果对指导临床合理选择抗生素、减少多重耐药菌株的产生具有现实意义，同时也为综合防治副溶血性弧菌提供依据。

综合食源性疾病监测系统信息发现，可疑食品暴露类别中，混合食品占比最高，其后依次为肉与肉制品、水产动物及其制品、水果类及其制品等，有明确分类的可疑食品以肉与肉制品所占比例最高，与本省2018 年度统计的的各市数据趋势一致[2]。副溶血性弧菌感染病例所涉及的可疑食品以水产品占比最高，这与副溶血性弧菌的生存特性及高温季节人们喜食生冷、凉拌海鲜水产密切相关。但主要进食场所为家庭和餐饮行业等场所的特征与文献[2]报道结果并不完全一致，2018 年汇总的全省监测病例进食场所主要为饭店(酒店)、单位食堂和学校食堂，导致这种差异的原因可能在于相关行政部门对这些场所管理督察力度加大，使集中就(供)餐场所发生食源性疾病的风险大大降低，而家庭自制和街头餐饮服务行业卫生意识相对薄弱，监管层面的漏洞使得食品安全隐患大大增加。因此，卫生部门仍需加强源头监督和市场流通环节管理，避免引起散发病例和暴发疫情的可能性。

食源性疾病监测是系统地、连续地收集疾病信息，及早识别食品安全隐患，开展预警，为加强食品安全监管提供靶向性指导。南通市自2013 年建立食源性疾病监测与溯源系统以来，通过疾控中心与哨点医院的加强协作，为制定食源性疾病防治策略提供了有力依据。今后应继续提升预警和防控能力，保障食品安全。