MicroRNA-384在脑胶质瘤细胞株中的表达以及临床意义*

陈 侠，赖满香，刘筱蔼，来慧丽

广东食品药品职业学院护理学院，广东 广州 510520

胶质瘤来源于神经胶质细胞，也是最常见的颅内恶性肿瘤类型，约占全部恶性肿瘤的75%。胶质母细胞瘤具有浸润性生长、恶性程度高、复发率高、难治愈等特点［1］。世界卫生组织将脑胶质瘤可分为Ⅰ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期为低分级，Ⅲ～Ⅳ期为高分级，其中Ⅰ期为良性，Ⅳ期侵袭性以及恶性程度最高，严重威胁患者的生命安全［2-3］。因此临床对于脑胶质瘤的发生机制、病情发生以及发展进行不断研究，以期寻找新的脑胶质瘤的基因治疗手段［4-5］。随着基因技术的发展，有研究学者利用芯片技术在胶质瘤细胞株检测到5 000 多个生物基因，其中多种MicroRNA 表达异常。MicroRNA 是一种具有调控功能的非蛋白质编码单链小分子RNA，可通过转录抑制翻译而发挥对基因调控作用［6-7］。近年来，有研究明确了MicroRNA-384在结肠癌、肺癌以及肝癌等多种恶性肿瘤细胞的发生机制中有着至关重要的作用，但未对MicroRNA-384在脑胶质瘤细胞株中表达变化进行阐述［8］。为此，本研究就MicroRNA-384在脑胶质瘤细胞株表达变化以及临床意义进行深入探究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究材料低分级脑胶质瘤细胞株（3 例）、高分级脑胶质瘤细胞株（5例）、正常脑组织细胞株（7例）均购买于中国科学院上海细胞生物所，RPMI1640 培养基、高糖DMEM、胎牛血清（FBS）均购买于杭州吉诺生物医药技术有限公司；总RNA 提取试剂盒购买于上海信裕生物科技有限公司；反转率试剂盒、PCR购买于美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞株培养 细胞株采用在含有高糖DMEM 与10%的胎牛血清培养基中进行培养，并放置在37 ℃且含有5%CO2的培养箱中培养，每天更换液体1次，3～4 d传代1次［9］。

1.2.2 RNA 的提取 根据总RNA 提取试剂盒说明书进行提取，将细胞株放置在微量离心机中以800 r/min 的低速离心处理3 min，应用巴斯德吸管吹打15～30 次，取单细胞悬液，放置在有RNA 酶的离心管中，加入三氯甲烷250 μL，充分摇匀后，静止5 min［13］。继续放置在离心机中分离。完成后，将液体吸干，放置在50 ℃环境中，促进RNA 进一步的降解。并应用分光光度仪测量所得RNA 的浓度，并将样本放置在-75 ℃环境冷冻处理［10］。

1.2.3 反转录 将无RAN 酶的PCR 管加入2 μg 的RNA 溶液，依次加入清洗缓冲液（5 μL）、反转录试剂（2 μL）、抑制剂（0.330 μL）以及逆转录酶（200 u/μL）后，得到cDNA［11-12］。

1.2.4 定量PCR 取0.2 μL cDNA 加入0.2 mL PCR 试剂管中，与2 μL 的5.5 μM 基因产物、2.5 μL 的cDNA、7.0 μL的去RNA 酶水进行PCR 反应，并应用U6 作为内参。95 ℃预变性5 min，40个循环，95 ℃15 s，60 ℃退火30 s［13］。

1.2.5 细胞培养及转染 脑胶质瘤细胞系U251 购买于中国科学院上海细胞生物所，用10%的胎牛学清、150 μg/mmL链霉素以及150 μg/mmL 青霉素高糖DMEM 培养基进行培养，参照转染试剂盒对胶质瘤细胞系转染MicroRNA-384。

1.2.6 Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭能力 将稀释好护的基质胶均匀铺垫在Transwell 小室，放置在室温37 ℃环境下凝固30 min，将转染后的细胞根据接种密度含有预处理后的6 孔板总，细胞接种在Transwell 小室，加入200 μL无血清中的DMEM 的培养基中，加入含有10%胎牛血清400 μL 中，应用无菌棉签擦拭Transwell 小室上表面的细胞和基质胶，并转移至晶紫染液总，温室反应15 min 后，在显微镜下挑选7 个计数拍照，计算其平均数，重复3 次实验。

1.3 统计学方法

采用SPSS 27.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

脑胶质瘤细胞株（8 株） MicroRNA-384 的含量为（0.25±0.08），与胶质瘤组织旁正常组织细胞株（7 株）中MicroRNA-384 的含量（0.37±0.05）比较，差异有统计学有意义（P＜0.05）。

不同病理分级脑胶质瘤细胞株中MicroRNA-384的含量比较，高分级脑胶质瘤细胞株（5 株）中MicroRNA-384 的含量（0.24±0.03）低于低分级脑胶质瘤细胞株（3 株）中MicroRNA-384 的含量（0.31±0.04），差异有统计学有意义（P＜0.05）。

不同时间MicroRNA-384 组的U251 细胞增殖抑制率高于正常细胞组，脑胶质瘤细胞株中MicroRNA-384表达受到抑制，随着培养时间延长其促进或抑制效果更明显，差异有统计学有意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组不同时间点U251细胞增殖情况（±s）

表1 两组不同时间点U251细胞增殖情况（±s）

组别不转染任何基因组（n=4）MicroRNA-384组（n=4）t值P值12 h 24 h 36 h 48 h 72 h 4.27±2.364.97±0.725.16±0.815.31±1.456.27±2.36 11.36±3.0117.36±5.2422.39±6.0129.19±6.3728.36±5.72 3.707 0.010 4.684 0.003 5.682 0.001 7.311＜0.001 7.139＜0.001

3 讨论

脑胶质瘤属于高发性恶性肿瘤，其发病率是人类脑瘤中的第2 位，仅次于脑膜瘤，中位生存期不足9 个月，且具有较高的侵袭性，手术后易复发，5年生存率不足3%［14］。目前，许多临床医生对于手术治疗脑胶质瘤力求全切，但是部分患者肿瘤生长位置较为特殊，在手术治疗后会存在部分残留。而对于脑胶质瘤的药物治疗相对单一，除低级别可全部手术切除的脑胶质瘤外，应采取放化疗治疗。但是在化疗药物中，特异性与疗效较高的药物较少，导致患者的生活质量以及预后得不到明显的改善，为此寻找新型的标记物对脑胶质瘤的早期诊断以及预后具有积极的影响。

近几年来，随着医学的发展，对miRNA 的不断深入研究，胶质瘤的治疗手段也取得较大的进展。miRNA 在疾病的发生发展占据不可估量的作用。miRNA 是一种可以通过RNA 序列转录成具有功能性的RNA 小分子，虽然不能转化为蛋白质，但是可对靶分子mRNA 进行识别并与其配对，导致蛋白质的翻译受到抑制，从而在多种疾病中发挥其独特的作用。一直以来，由于miRNAs不编码蛋白而未引起学者们的重视，但是人们发现30%以上的人类基因因miRNAs靶点而成为人类最丰富的调控基因之一。其不仅数量巨大，且在动植物细胞以及分子过程中具有关键的作用。另外，miRNA 可以通过mRNA 与调节基因调控蛋白，与肿瘤转移、发展等过程存在关联，发挥着抑制癌基因的生理作用。此外， miRNA 具有较为显著的组织特异性，尤其是在恶性肿瘤中表达更为明显。根据miRNA 这一特点，肿瘤细胞株中某种miRNA 的表达可作为肿瘤诊断标志物，为肿瘤的靶向治疗提供新思路。肿瘤细胞中存在miRNA的片段，不同miRNA 在肿瘤中所产生的生物学效应有所不同。miRNA 存在于肿瘤中的发生改变的染色体区域内，而肿瘤的易感性与miRNA 的病变、缺失、扩增相关。因而，检测肿瘤细胞株内的miRNA 对疾病的严重程度以及预后等具有积极的意义。本研究发现，MicroRNA-384 在脑胶质瘤中表达下调，且随着病理级别的升高，MicroRNA-384的表达水平显著下调。

MicroRNA-384 属于一种少有研究的保守型miRNA，随着基因技术的进步，越来越多的研究学者开始探索MicroRNA-384 在肿瘤细胞中的作用机制。有研究［15］发现，MicroRNA-384 在胰腺癌细胞株中呈低表达，并通过细胞体外侵袭实验发现MicroRNA-384 的上调可抑制肿瘤细胞的迁移以及侵袭。白晓斌等［16］研究中发现，在肺癌中，MicroRNA-384 的上调可抑制长链非编码RNA的NEAT1（核富集转录体）的分裂以及增值等。由此说明，MicroRNA-384具有抑制癌细胞的作用［16］。分析MicroRNA-384 可靶向的抑制PIWIL4 基因的转录后的翻译水平，继而可调节下游的STAT3、锌指转录因子、VEGF 的表达，从而促进体内的肿瘤细胞的消退。

本研究中，脑胶质瘤细胞株中MicroRNA-384 的含量明显低于胶质瘤组织旁正常组织细胞株中MicroRNA-384的含量。且MicroRNA-384 的含量随着脑胶质瘤病理分期的升高而降低。不同时间MicroRNA-384 组的U251 细胞增殖抑制率高于正常细胞组。不同时间MicroRNA-384 组的U251 细胞增殖抑制率高于正常细胞组，脑胶质瘤细胞株中MicroRNA-384 表达受到抑制，随之培养时间延长其促进或抑制效果更明显，表明MicroRNA-384 在脑胶质瘤的发生发展中有着重要的意义，且随着肿瘤的恶性程度增加而表达降低。通过体外细胞实验表明，MicroRNA-384 可表达抑制肿瘤细胞增殖与侵袭。

综上所述，MicroRNA-384 在脑胶质瘤中呈低表达，且随着病理分级程度的升高而降低，脑胶质瘤细胞株中MicroRNA-384 表达受到抑制，随之培养时间延长其促进或抑制效果更明显，且不同时间MicroRNA-384 组的U251细胞增殖抑制率高于正常细胞组，其含量的测定可评估脑胶质瘤分化程度，为临床靶向治疗提供新思路。