SPRY2 基因在细胞表型中的研究进展

梅其杰 胡 琪 徐文飞 郭锦荣 李崇铭 张久一 袁长深 段 戡▲

1.广西中医药大学第一附属医院关节四肢创伤骨科，广西南宁 530023；2.广西中医药大学研究生学院，广西南宁 530000

众所周知，目前许多疾病的病因病机尚未得以攻克。而随着分子生物学技术的进步，这些疾病的机制逐渐得以证实。细胞表型及其功能的研究可以帮助了解相关基因、蛋白、药物的机制，进一步解析疾病的病因病机，其渐渐成为基础研究不可或缺的手段。科研工作者运用生物分子检测手段判断细胞表型及功能，推断目的基因在组织细胞中的功能，进而阐述目的基因在相关疾病发生发展中的作用机制。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）、信使RNA（messengerRNA，mRNA）组成的表达网络lncRNA/miRNA/mRNA 作为当前研究的热点，其中mRNA 作为通路的下游因子，在细胞表型及功能的调控中起着关键作用。快速发育生长因子同源蛋白（sprouty，SPRY）作为一种关键的mRNA，是体内受体酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase，RTKs）信号传导的抑制剂[1]，参与调控多种疾病发展；其在细胞中表达量的差异性会诱导出不同的细胞表型。由SPRY 转录翻译的SPRY 蛋白是许多生长因子的共同拮抗剂，在调节生物体的生长和发育方面起着极为重要的作用。目前有4 种亚型：SPRY1、SPRY2、SPRY3 和SPRY4，其中备受关注的是SPRY2。与其他亚型比较，SPRY2 对RTKs 体酪氨酸激酶信号通路的抑制作用显著增加，其独特的生物效应在细胞表型的诱导中起着重要作用。冀为让临床工作者更充分地分认识SPRY2 在不同细胞表型中的功能，本文通过整理文献并进行归纳；同时为SPRY2 的研究提供有力的理论支持。

1 SPRY 基因与蛋白

1.1 SPRY2 基因

SPRY 家族最早在果蝇基因的研究中发现，后来在哺乳动物中发现4 个家庭成员SPRY1、SPRY2、SPRY3和SPRY4。SPRY 作为RTKs 调控成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）信号通路的拮抗因子。随后，在人类胚胎干细胞中进一步证实SPRY2 是RTKs信号传导和细胞过程的调控关键因子；其功能包括调控细胞活力[2]、新陈代谢、迁移[3]和细胞周期[4]控制等。在人类组织样本中，SPRY2 广泛表达于人体组织，如肾上腺、阑尾、骨髓等。SPRY2 的表达受复杂、多层次的不同信号通路调控，其复杂的生物学功能由其翻译合成的蛋白来实现。

1.2 SPRY2 蛋白的结构特点

SPRY2 是一种含硅和含铁的蛋白质，运用透射电子显微镜三维重构其结构，呈现出类似“甜甜圈”的形状，带有两个松散连接的唇盖部分，7 个大小不等的裂片和2 个部分覆盖其孔两侧的唇裂，总共是9 个裂片。SPRY2 蛋白含有315 个人类氨基酸残基（35 kD），178-282 C’末端残基富含半胱氨酸。SPRY2 抑制多种RTKS 信号蛋白和调节细胞增殖过程主要由其独特的、高度保守的、富含半胱氨酸的C’端结构域参与，该区域是SPRY2 膜易位所必需的。而SPRY2 蛋白的N’末端部分不太保守，这些序列差异可能是SPRY 蛋白之间功能差异的原因[5]。

2 SPRY2 的功能

SPRY2 通过拮抗RTKs 信号传导及与各种生长因子相互作用赋予细胞特定的形态和功能，导致不同的细胞表型，包括增殖、凋亡、迁移、侵袭、自噬、上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和血管生成等。

2.1 细胞增殖

SPRY2 作为调节细胞增殖重要的mRNA[6]，可通过调控细胞增殖影响癌症的进展[7]。Liao 等[8]研究发现，下调SPRY2 表达可以增强RTK 活性并激活RTK/Ras/MAPK 信号通路，从而促进成骨细胞增殖。动物实验研究发现[9]，过表达SPRY2 可抑制小鼠成骨细胞增殖表达；相反，用小干扰RNA 沉默SPRY2 后，与转染对照组细胞比较，FGF 诱导的细胞外调节蛋白激酶1和2 活化增加。体外细胞实验中[10]，集落形成测定法发现过表达ALKBH5 可抑制结直肠癌细胞增殖，敲低miR-21 可阻断ALKBH5 pcDNA3.1 和FOXO3shRNA 的联合作用，而SPRY2 shRNA 则可以逆转这种作用；而在卵巢癌细胞的研究中发现[11]，敲低SPRY2可挽救GAS5 对A2780 细胞增殖的抑制作用；表明SPRY2 可影响细胞生长，为调控癌细胞增殖的关键mRNA。

SPRY2 本身不仅可有效调控细胞增殖，而且其增殖能力还具有特异性[12]。在Sprouty 家族中，SPRY2 和SPRY4 对细胞增殖的影响存在差异[13]：在骨肉瘤SPRY2 和SPRY4 蛋白水平低内源性细胞系U2OS 细胞中，SPRY4 异位表达10 d 后测量的细胞克隆数量并没有减少，而SPRY2 表达使U2OS 细胞的克隆量减半；与SPRY4 比较，过表达的SPRY2 对U2OS 细胞在96 h 内并没有翻两番，而对照细胞几乎翻了两番。同样，在野生型小鼠中[14]，SPRY2 在产前第18 天在胫骨的所有细胞类型中大量表达；表明SPRY2 对细胞增殖具有明显的特异性。

2.2 细胞凋亡

细胞凋亡表现多基因（Bcl-2 家族、caspase 家族[15]等）严格控制的过程，该过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，但具体过程及确切机制尚不完全清楚。敲除SPRY2 可调控ERK 信号，增加促MAPK 的活性，而MAPK 可促进凋亡Bcl-2 家族成员Bad 和Bim 的去磷酸化，从而诱导细胞凋亡导致黑色素瘤细胞死亡[16]。在胰腺癌细胞中，沉默SPRY2 可促进胰腺癌细胞从G0/G1期向S 期的转变，减少凋亡细胞的数量；过表达SPRY2 对MIA PaCa-2 细胞的细胞周期进展和凋亡具有相反的影响[17]。为确定SPRY2对细胞凋亡的作用，蛋白质印迹法分析显示，敲低SPRY2 导致Bax 和裂解半胱天冬酶3 的蛋白表达降低，而Bcl-2 蛋白表达增加，抑制细胞凋亡[18]。上述研究表明，SPRY2 在高水平表达时具有抗凋亡功能。

2.3 细胞迁移

细胞迁移逐渐成为当前细胞生物学研究的热点，可作为认识相关疾病机制的另一条新线索。为明确SPRY2 对细胞迁移的调控作用，在肝癌干细胞中，miR-22-3p 降低了SPRY2 的泛素化并使其稳定，可抑制肝癌干细胞迁移和侵袭[19]；在成纤维样滑膜细胞中，过表达SPRY2 可有效抑制成纤维样滑膜细胞的迁移和侵袭，降低了炎症因子[20]。为进一步了解SPRY2 对细胞迁移的特异性，分别用SPRY2 和SPRY4两种腺病毒感染高内源性SPRY 蛋白水平的骨肉瘤MG63 细胞系，并在感染后48 h 进行划痕测定，发现当仅SPRY2 过表达时，间隙缩小的时间显著延迟，过表达SPRY2 可调控细胞迁移（1 h 内）覆盖12 μm 的距离，而对照处理的细胞移动速度快约1.3 倍；而过表达SPRY4 不仅增加间隙闭合的速度，还起到非抑制作用[21]。另外在胰腺导管腺癌中发现[22]，SPRY2 可有效调控胰腺导管腺癌PANC-1 和SW1990 两种细胞系的迁移速度；同时经跨孔迁移和侵袭试验表明，敲除SPRY2 后细胞侵袭数量明显增加，而过表达SPRY2 可显著抑制两种细胞系的迁移和侵袭能力；这表明SPRY2 为调节胰腺导管腺癌细胞中的迁移能力关键mRNA。

2.4 细胞侵袭

细胞侵袭是正常细胞和癌细胞应对化学和机械刺激的反应，又称为细胞吞噬。SPRY2 作为MAPK 信号传导的调节剂，在调节癌细胞侵袭中起着关键作用[23]。一项在体研究中发现，SPRY2 作为肝内胆管癌侵袭的肿瘤抑制因子，FGF1 刺激可显著增加FGF 受体2 表达正常的肿瘤侵袭，但当FGF 受体2 被敲低时，HuCCT-1 细胞的侵袭减少，当SPRY2 被敲低时增加[24]。为了证实细胞迁移和侵袭的影响是否由SPRY2 介导，利用HepG2 模拟细胞，HepG2 过表达miR-22-3p细胞和HepG2 过表达miR-22-3p/SPRY2 敲低细胞的Transwell 迁移测定和基质凝胶侵袭测，表明SPRY2 可有效调节细胞侵袭[25]。进一步研究发现，将SPRY2 的载体引入A549-CUG2 细胞，发现过表达SPRY2 可抑制CUG2 诱导的细胞迁移和侵袭[26]；而沉默SPRY2 可升高MCF7 细胞中金属蛋白酶水平，使细胞的侵袭能力明显增强[27]。

2.5 细胞自噬

自噬作为细胞的一种自我保护机制，在真核细胞中广泛存在，作为调节细胞生存和死亡的关键因素。细胞自噬基因突变会导致疾病，尤其是在肿瘤、炎症及神经系统等疾病[28]。有研究将miR-122 Agomir 转染到氧葡萄剥夺诱导的小鼠脑神经瘤细胞系N2a 中，发现过表达miR-122 可下调SPRY2 活力，降低N2a 细胞的细胞凋亡、细胞周期停滞和自噬；同时，观察到S期细胞数量升高，用miR-122 Agomir 进行蛋白质印迹分析以评估细胞凋亡（Bax 和活性半胱天冬酶-3）和自噬相关蛋白（Beclin-2 和LC3B-Ⅱ），结果发现，用miR-122 Agomir 转染后氧葡萄剥夺处理的N2a 细胞中Bax、活性半胱天冬酶-3、Beclin-2 和LC3B-Ⅱ的表达下降，提示低表达SPRY2 能够抑制细胞自噬，加重缺血性卒中的神经损伤[29]；同样，敲低SPRY2 可消除miR-22-3p 对细胞迁移和侵袭的抑制作用[19]。因此，SPRY2 有望成为研究细胞自噬的热点。

2.6 EMT

EMT 是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，而通过EMT，可获得较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。某些炎症细胞来源的细胞因子，特别是转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGFβ）的表达升高，参与EMT，导致多种纤维化疾病的发病机制，而SPRY2 对TGFβ 信号具有负调控作用。为了进一步剖析SPRY2 如何调节TGFβ2诱导的EMT 和迁移的机制，在晶状体上皮细胞中检测ERK1/2 的磷酸化水平，发现它们分别参与规范和非规范TGFβ 信号通路的激活，表明SPRY2 通过抑制ERK1/2 磷酸化[30]来抑制TGFβ 信号传导；另外，SPRY2 还可通过甲基化[31]增加了结直肠癌的癌症表型和EMT。Liu 等[32]研究发现过表达SPRY2 可抑制miR-23b 表达，从而促进晶状体上皮细胞的迁移和EMT。因此，SPRY2 对EMT 起关键调节作用。

2.7 血管生成

血管生成作为疾病的发展转移过程的重要因素，其机制复杂，且参与并促进血管生成的因子也众多。SPRYT 蛋白的N’端区域是高度发散的，除了果蝇和哺乳动物蛋白之间相似的两个小区域。其中一个区域已被证明与泛素连接酶c-Cbl 结合，泛素连接酶c-Cbl 是RTK 信号传导的已知负调节剂。c-Cbl 介导表皮生长因子受体、血小板衍生生长因子受体和集落刺激因子1 受体等多重泛素化，从而靶向通过蛋白酶体/溶酶体途径降解[33-34]。SPRY2 作为膜锚定蛋白，可负调节血管生成相关RTKs 信号传导并抑制血管生成，过表达SPRY2 可抑制FGF2 和血管内皮生长因子诱导的内皮细胞增殖和分化[35]。在外泌体miR-21靶向SPRY2 的研究中，证实miR-21/SPRY2 轴在正常血管上皮细胞生成和上皮表型调节中起关键作用[36]。

3 展望

SPRY2 作为一个双抑制因子，广泛表达在多种组织中，属于Sprouty 家族的蛋白质。该蛋白间接参与非细胞自主抑制作用对成纤维细胞生长因子的信号传导；与Cas-Br-M（小鼠）外向逆转录病毒转化序列相互作用，可作为EGF/MAPK 信号传导的双峰调节剂。已经发现SPRY2 可以抑制癌细胞恶性行为的核心细胞功能，包括细胞增殖、分化、迁移和侵袭。还与甲基化、泛素化关系密切。最近，细胞表型在规模、分辨率和通量方面进行了大规模的改革，这归因于成像细胞。

SPRY2 作为MAPK 信号通路的重要抑制因子，发挥着抑制细胞增殖、分化及迁移等生物学功能。研究发现，SPRY2 可作为一种抑癌基因分子，在多种癌症中得以证实，如前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌和肺癌等肿瘤细胞中的表达被明显抑制，从而使得RTKs 等信号通路逃避抑制而被过度激活，造成肿瘤细胞异常增殖，从而促进了肿瘤的发生和发展。当SPRY2 高表达时，能够显著地抑制细胞的增殖、生长和迁移。并且，SPRY2 还能够明显地促进细胞黏附、伸展。SPRY蛋白也被证实能够与某些膜蛋白，如Cav-l，发生直接的相互作用，进而实现其抑制细胞增殖、迁移等生物学效应。

检测细胞的表型，可以帮助了解相关基因、蛋白、药物的机制，是科学研究不可或缺的手段。而SPRY2参与多种细胞表型，作为一种关键的mRNA，值得去挖掘深究。