鸡传染性喉气管炎病毒贵州株gC基因的遗传进化分析

杨 婷, 孙 芸, 温贵兰, 徐 飞

(贵州大学动物科学学院,贵州 贵阳 550025)

鸡传染性喉气管炎(Avian infectious laryngo tracheitis,AILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectiouslaryngotracheitisvirus,ILTV)引起鸡的急性、接触性呼吸道传染病,主要通过呼吸道和消化道传染,患病禽、带毒禽及被污染的物料是主要传染源[1,2]。临床表现呼吸困难,张口呼吸,发出异样声音,咳出带血黏液,严重危害家禽养殖业[3]。ILTV是有囊膜DNA病毒,属于疱疹病毒科、疱疹病毒属,病毒粒子呈二十面体(直径200～350 nm),囊膜表面稍有小凸起,衣壳蛋白呈正二四十面体对称(约155 kb),与单纯疱疹病毒结构相似。gC蛋白是病毒的糖蛋白,大多数α疱疹病毒的gC蛋白对感染具有多种重要功能,包括病毒对细胞表面蛋白多糖的乙酰肝素或硫酸软骨素的主要附着作用,但也有研究表明ILTV的gC蛋白并没有这个作用,对病毒粒子的成熟和释放也非必需,gC蛋白可能直接参与病毒细胞间的传播[4]。此外,gC基因被证明具有免疫逃避功能[5]。本试验对ILTV贵州株(GZNY202112株)的gC基因进行PCR扩增、克隆、测序,并进行遗传变异分析,为AILT的防控及疫苗研制提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 病毒株

ILTV GZNY202112株由贵州省纳雍县某蛋鸡场发病鸡群的喉头、气管、肺脏等组织病料中分离,保存于贵州大学动物疫病实验室。

1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒(购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司),DL 2 000 DNA Marker、Pri-meSTAR®Max DNA Polymerase、Taq-Plus PCRMaster Mix(2×)、pMD-19T载体、M Buffer、连接酶 SolutionⅠ(均购自上海恒斐生物科技有限公司),限制性内切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ[均购自宝生物(大连)工程有限公司],质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞[均购自天根生化科技(北京)有限公司]。

1.3 主要仪器

全自动数码凝胶成像系统(型号:Tanon-1600,上海天能科技有限公司)、多功能梯度PCR仪(型号:VeritiTM96-Well Thermai Cycyer,美国ABI公司)、电泳仪器电源(型号:DYY-8C,北京市六一生物科技有限公司)、恒温培养摇床(型号:QYC-2102C,上海新苗医疗器械制造有限公司)。

1.4 引物设计合成

参考GenBank数据库ILTVgC基因序列(登录号:JN969091.1),设计1对特异引物,由生工生物工程(上海) 有限公司合成。引物信息见表1。

1.5 PCR扩增

按照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书方法提取ILTV DNA,以此为模板进行PCR扩增。反应体系50 μL:DNA模板4 μL, PrimeSTAR®Max DNA Polymerase 25 μL,上、下游引物(10 pmol/μL)各2 μL,ddH2O 17 μL。反应条件:98 ℃ 2 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,共39个循环;72 ℃ 10 min。 扩增产物经1.2%凝胶电泳检测。

1.6 pMD-19T-gC质粒的构建

将PCR目的片段按胶回收试剂盒说明书方法进行回收纯化,纯化后的PCR产物与pMD-19T载体连接。连接体系10 μL:连接酶 Solution Ⅰ 5 μL,纯化PCR产物4 μL,pMD-19T载体1 μL。连接条件:4 ℃过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,转化方法:将大肠杆菌DH5α感受态细胞菌液1 mL 加入LB液体培养基(50 mL),37 ℃ 150 r/min活化1.5 h,将活化菌液200 μL均匀涂布于含氨苄青霉素的 LB固体培养基,37 ℃培养 18 h。

1.7 筛选pMD-19T-gC阳性质粒

挑取单个菌落进行PCR检测,相应单菌落培养液提取重组质粒,并进行质粒PCR鉴定和双酶切鉴定。质粒PCR扩增反应体系及程序同“1.5”。双酶切体系50 μL:EcoRⅠ2.5 μL,Hind Ⅲ 2.5 μL,10×M Buffer 5 μL,重组质粒DNA 27 μL,ddH2O 13 μL。双酶切条件:37 ℃恒温水浴过夜。经质粒PCR、双酶切鉴定为阳性的重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序。

1.8 序列分析

使用DNAStar生物信息学软件将GZNY202112株gC基因的测序结果与GenBank收录的12株ILTV(见表2)核苷酸序列及氨基酸序列进行同源性分析,并构建gC基因遗传进化树。

表2 参考毒株信息

2 结果与分析

2.1gC基因PCR扩增

由图1可见:GZNY202112株gC基因扩增产物长度为1 258 bp,与预期相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:接毒的细胞上清液;2:阴性对照

2.2 重组质粒PCR鉴定

由图2可见:重组质粒PCR扩增产物长度为1 258 bp,与预期相符,表明pMD-19T-gC重组质粒中包含gC基因。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:阴性对照;2、3:重组质粒

2.3 重组质粒双切酶鉴定

由图3可见:重组质粒酶切产物分别为2 692、1 258 bp,与载体、GZNY202112株gC基因长度相符,表明pMD-19T-gC重组质粒构建成功。

M:DL 2 000 DNA Marker;1:重组质粒;2:gC基因

2.4 GZNY202112株gC基因的同源性分析

由图4可见:GZNY202112株gC基因序列与12株参考毒株gC基因的同源性为97.7%～98.9%。与参考株相比,GZNY202112株gC基因仅有2个碱基发生突变:与CAN分离株、VFAR-043 分离株、Jiangsu-2011-3分离株、SA2疫苗株、A20疫苗株、Hongkong分离株、xingyang分离株、LJS09分离株、WG强毒株、K317疫苗株在第50位处出现1个碱基突变(G50A);与LJS09分离株、WG强毒株、K317疫苗株、Hongkong分离株、xingyang分离株存在1个碱基突变(A957G)(见图5)。说明GZNY202112株的gC基因突变数量极少,遗传进化稳定,变异程度低。

图5 gC基因碱基序列比对分析

2.5 GZNY202112株gC基因遗传进化树分析

由图6可见:GZNY202112株与澳大利亚疫苗株CSW-1(登录号:MF156850)处于同一小分支,亲缘关系最近,而与国内K317疫苗株(登录号:JX458824)处于不同分支,亲缘关系较远。

图6 gC基因遗传进化树

2.6 GZNY202112株gC蛋白氨基酸序列分析

基于核苷酸序列推导出氨基酸序列,由图7可见:GZNY202112株gC氨基酸序列与其他参考株的同源性为97.6%～98.1%。与CAN分离株、VFAR-043 分离株、Jiangsu-2011-3分离株、SA2疫苗株、A20疫苗株、Hongkong分离株、xingyang分离株、LJS09分离株、WG强毒株、K317疫苗株相比,仅有1个氨基酸位点发生突变(S17N)(见图8)。

图7 gC蛋白氨基酸序列同源性分析

图8 gC蛋白氨基酸序列比对分析

3 结论

GZNY202112株gC基因存在2处碱基突变和1处氨基酸位点差异,遗传较稳定,进化保守,没有单独形成进化分支,未发生明显变异。

4 讨论

4.1目前防控ILTV的有效方法主要通过疫苗接种,常用疫苗有弱毒疫苗、基因重组疫苗[6]。2013年赵妍等[7]进行了3株ILTV全基因组测序,测序结果与国外已公布的序列比对显示,ILTV-LJS09株的大部分开发阅读框(open reading frame,ORF)与参考毒株的同源性高,其中gC基因呈现高度保守。本试验也进一步验证了ILTVgC基因的保守性。相关研究对ILTV的gB、gD、gE、TK基因进行遗传变异趋势分析,结果显示多数毒株的基因进化保守,变异不明显,但是国内外ILT疫苗毒株存在毒力返强的风险[8],1月龄内肉鸡发生ILT的病例不断攀升,呈现出新的发病特点和流行趋势。此外,研究表明ILTVgC基因具有免疫逃避功能[5],其缺失可能会提高ILTV 活疫苗的功效。

4.2本研究表明,GZNY202112株与澳大利亚野毒株亲缘关系最近,与国内K317疫苗株亲缘关系较远,说明该毒株很可能由澳大利亚传入,并在贵州地区流行,提示在疫苗的选择上不同地区要有针对性,才能取得到较好的免疫效果。