肾移植受者早期霉酚酸暴露量估算模型研究Δ

张寒娟 ，丁建强 ，韩文超 ，陈永妍 ，王高彪 ，丁蕊 ，袁冬冬 （.郑州市第七人民医院药学部，郑州 45006；.武警河南总队医院药学部，郑州 45005）

吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）作为新型抗代谢免疫抑制剂在器官移植中被广泛应用，其口服吸收后，可迅速水解为次级代谢产物——霉酚酸（mycophenolic acid，MPA）[1—2]。MPA的血药浓度-时间曲线下面积（area under the plasma concentration-time curve of MPA，MPA-AUC）与其临床疗效和药物不良反应（adverse drug reaction，ADR）密切相关，但不同受者服用相同剂量的MMF，其MPA-AUC个体差异可达10倍[3]。MPA在代谢过程中存在肝肠循环现象，导致其谷浓度难以反映真实的治疗效应，目前临床多推荐MPA-AUC0-12h作为MMF的治疗药物监测指标[4]。但是测定一个完整12 h给药间隔的AUC，往往存在采样点密集、受者依从性差等缺陷[5]，因此，MPA血药浓度监测通常采取有限采样（limited sampling strategy，LSS）法，即利用1～4个采样点预估MPA-AUC0-12h，操作方便、更具临床可行性[6—7]。目前关于肾移植受者估算MPA-AUC0-12h模型的研究大多为肾移植术后稳定期受者[8]，但由于早期受者合并用药较多、生理指标未完全恢复等，移植早期反而更易出现MPA暴露量不足（MPA-AUC0-12h＜30 mg·h/L）的情况，且患者的药动学特征可能与稳定期受者存在差异，因此建立肾移植受者早期的MPA-AUC0-12h估算模型非常必要[9—10]。为此，本研究纳入了肾移植术后15 d的受者，采用LSS法建立了肾移植受者早期MPA暴露量的估算模型，旨在为临床监测MPA的暴露量提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2021-2022年在郑州市第七人民医院首次接受肾移植手术的患者。本研究方案通过郑州市第七人民医院医学伦理委员会审查批准（批件编号为2021-05-001），并且所有参与本试验的患者在试验前均被告知试验目的和内容，并签署知情同意书。

本研究的入选标准为：（1）术后接受MMF+他克莫司+甲泼尼龙三联免疫抑制治疗方案；（2）1周内MMF给药剂量无变化；（3）可以获得完整的药动学参数。

本研究的排除标准为：（1）有肝炎或肝功能异常受者；（2）同时服用含有氢氧化镁或氢氧化铝等抗酸剂或考来烯胺等可能影响MPA吸收及肝肠循环的药物者；（3）有活动性消化道溃疡者，存在严重免疫抑制药相关药物不良反应者，尤其是胃肠道反应者；（4）近期发生临床确诊的急性排斥反应或感染者。

1.2 免疫抑制治疗方案

所有参与试验的肾移植受者均采用三联免疫抑制方案：MMF+他克莫司+甲泼尼龙：术后首日开始口服吗替麦考酚酯分散片（杭州中美华东制药有限公司，国药准字H20052083，规格0.25 g）500 mg，q12 h，术后3 d调整剂量为750 mg，q12 h；术后2 d左右开始口服他克莫司胶囊（杭州中美华东制药有限公司，国药准字H20084514，规格1 mg）1 mg，q12 h，并根据他克莫司血药浓度调整剂量；术前、术后第1天、术后第2天给予兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白（Genzyme Polyclonals S.A.S.，国药准字J20150136，规格25 mg/瓶）25 mg，qd（亲属肾移植除外）；术后第1天静脉滴注注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（Pfizer Manufacturing Belgium NV，国药准字HJ20170197，规格4 mg）500 mg qd，术后第2天调整剂量为250 mg，qd，术后第3天起改为口服甲泼尼龙片（Pfizer Italia Srl，国药准字H20150245，规格4 mg）8 mg，qd维持。

1.3 检测仪器与试剂

本研究所用主要仪器包括2D-LC-UV全自动二维液相色谱-紫外检测系统[由FLC2420全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）以及液相色谱LC-20AT部件（日本岛津公司）构成]、XW-80A型涡旋混合仪（上海琪特分析仪器有限公司）、TDZ4-WS型低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、Mini-15K微型高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）。

Aston SC2T（3.5 mm×50 mm，5 μm）色谱柱、Aston SBR（3.0 mm×10 mm，5 μm）色谱柱、Aston SBX4（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱、MPA质控品（批号20210922）、MPA校准品（批号20191120）、ORG-2去蛋白剂（批号20210705）、MPA-1A移动相、MPA-2A移动相均购于湖南德米特仪器有限公司；试验用水为怡宝纯净水。

1.4 血样采集方法

待受者服用MMF达到稳态后，于术后第15天采集当日服药前以及服药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0 h的血样，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，以3 000 r/min离心5 min，取上清液放于-20 ℃冰箱中，待测。

1.5 血药浓度测定方法

本研究采用本课题组已建立的全自动二维液相色谱法测定人血浆中MPA的浓度[11]。取血浆400 μL，加至含1 000 μL ORG-2去蛋白剂的1.5 mL聚丙烯管中，涡旋混匀后，置于高速离心机中，以14 500 r/min离心10 min，取上清液，置于1.5 mL进样瓶中，待测。色谱条件如下：一维色谱柱为Aston SC2T（3.5 mm×50 mm，5 μm），一维流动相为MPA-1A移动相，流速为0.8 mL/min；转移柱为Aston SBR（3.0 mm×10 mm，5 μm），流动相为纯净水；二维色谱柱为Aston SBX4（4.6 mm×150 mm，5 μm），二维流动相为MPA-2A移动相；各色谱柱柱温均为40 ℃，紫外检测波长为304 nm，采用等度洗脱，进样量为200 μL。经检验，MPA在0.32～25.03 μg/mL线性范围内呈良好的线性关系；该方法的各项方法学指标均符合生物样品测定要求。

1.6 分析指标与统计学方法

采用SPSS 21.0软件录入数据，数据以±s表示；使用WINNOLIN软件进行药动学分析，计算给药前血药浓度（c0）、药峰浓度（cmax）、药峰时间（tmax）、半衰期（t1/2）、AUC0-12h；使用SPSS 21.0软件进行统计分析，采用多元逐步回归法，分析各个时间点MPA浓度（任意一点或多个时间点）与AUC0-12h的相关性，根据各个时间点的相关系数（R2），逐步回归分析得到R2较大的简化计算公式。再按下列公式计算相对预测误差（relative prediction error，RPE）、相对预测误差绝对值（absolute relative prediction error，ARPE）、平均相对预测误差（mean relative prediction error，MRPE）：RPE（%）＝（AUC预测值-AUC实测值）/AUC实测值×100%，ARPE（%）＝|RPE|，MRPE（%）＝1/n∑ARPEi（i指患者编号）；使用拟合曲线评价MPA简化计算公式与MPA-AUC0-12h的拟合情况；使用GraphPad Prism 8.0软件中的Bland-Altman方法评价简化计算公式预测值与经典药动学方法之间的一致性，使用x±1.96SD（SD即标准差）来绘制上下限的线表示数据的离散程度，覆盖95%的数据[12]。

2 结果

2.1 受者基本资料

本研究纳入肾移植受者20名，其中男性17例（占85.0%），女性3例（占15.0%）；平均年龄（36.00±7.83）岁，平均体重（66.17±7.41）kg，体重指数（22.53±2.40）kg/m2。他克莫司的谷浓度为（7.93±1.71）ng/mL、峰浓度为（18.24±5.43）ng/mL，白蛋白水平为（40.94±2.62）g/L，血肌酐水平为（97.80±24.47）μmol/L。

2.2 MPA的药动学特征

20例肾移植受者的MPA-AUC曲线（图1）显示，部分受者曲线出现双峰现象，MPA的c0、cmax、tmax变异度相差较大。MPA的药动学参数（表1）如下：c0为（1.53±0.84）μg/mL，cmax为（12.07±5.97）μg/mL，t1/2为（5.41±3.67）h，tmax为（1.58±0.75）h，fAUC0-12h（按经典药动学方法计算出的AUC0-12h）为（33.95±13.40）μg·h/mL。

表1 20例肾移植受者体内MPA药动学参数

图1 20例肾移植受者体内MPA-AUC曲线图

2.3 多元回归模型的分析结果

将单个时间点的MPA血药浓度与fAUC0-12h进行相关性分析，结果（表2）显示，单一时间点的MPA血药浓度与fAUC0-12h相关性均较低（R2＝0.008～0.826），其中，c0与fAUC0-12h的相关系数R2仅为0.186，6.0、8.0 h时的MPA血药浓度与fAUC0-12h的相关性最高，R2分别为0.792、0.826。

表2 MPA-AUC0-12 h简化计算公式及相关参数

进一步将MPA多个时间点血药浓度与fAUC0-12h通过多元线性逐步回归分析拟合简化计算公式，结果（表2）显示，多个时间点的MPA血药浓度所拟合出的简化计算公式的R2明显高于单个时间点，且公式纳入的采样点越多，拟合出的简化计算公式的R2就越高。考虑到检测成本和受者的依从性，以2～4个时间点作为采样点较为合适。经分析，“4.0、8.0、12.0 h”三点采样和“1.0、4.0、8.0、12.0 h”四点采样这两种采样时间点组合的R2分别为0.934、0.961，MRPE分别为9.96%、8.65%，ARPE＞15%的比例均为10%，R2均高于“4.0、8.0 h”两点采样（R2为0.890），MRPE和ARPE＞15%的比例均低于“4.0、8.0 h”两点采样（MRPE为12.30%，ARPE＞15%的比例为20%）。可见，三点采样和四点采样的预测精度相当，均优于两点采样。考虑到采样时间点越少操作越方便，受者越易接受，故本研究最终选择“4.0、8.0、12.0 h”三点采样的MPA血药浓度用于预测AUC0-12h，其拟合出的计算公式为AUC0-12h＝12.058+2.819c4.0+7.045c8.0+3.879c12.0，预测的AUC0-12h与fAUC0-12h相关性较好，R2为0.934。Bland-Altman分析结果（图2）显示，上述计算公式预测的AUC0-12h与fAUC0-12h一致性较好，有19例（占95.0%）在x±1.96SD范围内。

图2 MPA的预测AUC0-12 h与fAUC0-12 h的一致性考察结果

3 讨论

MMF是器官移植术后三联免疫抑制方案中常用的免疫抑制剂，其代谢产物MPA的体内代谢过程易受年龄、体重、基因以及合用药物等多重因素的影响，导致受者的个体差异大。应用治疗药物监测评估MPA体内暴露量，以提高药物疗效，减少不良反应，是十分必要的。目前，LSS法因其采样点少、监测成本低、受者痛苦少以及预测精度良好等优势，已成为临床MPA-AUC0-12h监测的常用策略。

由以往关于LSS法估算实测AUC的研究可见，LSS法估算模型常因不同给药剂量、剂型、给药方案、药物监测方式以及不同受者人群的影响，导致拟合出的简化计算公式差别较大[8—10，13]。若要拟合出更为精准的简化计算公式，需对研究过程的条件和检测结果作出更准确的限定。在合并用药方面，本研究选择了合用他克莫司的受者人群，他克莫司对MPA的体内暴露量影响较环孢素更小，有利于提高拟合结果的预测精度。相比于以往研究通常采用的留置针采血的方式，本研究采用小针多次采血的方式，能保证各时间点MPA血药浓度的真实可靠——因为留置针中会有部分冲管液，如果直接从留置针取血，冲管液会混到血样中，稀释药物浓度，致使检测值偏低。此外，目前报道的MPA浓度检测方法有高效液相色谱法、均相酶免疫分析法等，本研究采用的是本课题先前建立的全自动二维液相色谱法，该方法操作简便、成本低、准确度高。

本研究针对采用MMF（750 mg，q12 h）+他克莫司+甲泼尼龙三联免疫抑制方案的受者，监测其不同时间点MPA的血药浓度，基于LSS法拟合估算了MPAAUC0-12h的预测模型。结果发现，MPA的tmax为（1.58±0.75）h，部分受者出现了双峰现象，说明MPA存在肝肠循环；fAUC0-12h为（33.95±13.40）μg·h/mL，个体间差异较大。通过分析单一时间点MPA的血药浓度与fAUC0-12h的相关性发现，相关性均较差，其中，c0与fAUC0-12h的相关性R2仅为0.186，c8.0与fAUC0-12h的相关性最高，R2为0.826，ARPE＞15%的占比仅为30.0%，预测精度仍较低。这一结果证实，仅通过测定c0或任一单一时间点的MPA浓度无法准确反映MPA的体内暴露量。本研究又采用多元线性逐步回归分析拟合出了基于LSS法估算MPA-AUC0-12h的简化计算公式，经验证，使用“4.0、8.0、12.0 h”三点采样的血药浓度估算MPAAUC0-12h的效果较好，预测值与fAUC0-12h有很好的相关性及一致性，ARPE在临床可接受范围内，简化计算公式为：AUC0-12h＝12.058+2.819c4.0+7.045c8.0+3.879c12.0。若采用两点采样法，尽管减少了采血次数，但预测精度明显降低；若增加采样点，拟合出的简化计算公式预测精度虽然更高，但是这样势必会造成采样次数太多、时间较长，不利于临床应用。

本研究建立了肾移植受者早期服用MMF合并他克莫司时体内MPA-AUC0-12h的估算模型，通过控制入组受者类型（均为移植术后早期受者）、MMF剂型和用量以及使用更准确的检测方法等，使拟合出的MPAAUC0-12h简化计算公式更具有针对性，能够为临床提供更加精准的MPA-AUC0-12h估算结果。但本试验也存在一定不足，如本研究纳入的样本量较少，拟合出的简化计算公式仍需经大样本数据的优化和验证。今后，本课题组将进一步扩大样本量进行相关研究。