碳量子点对大鼠的免疫安全性评价*

王 莹 黄郑隽 翁少煌

1 福建省立医院,福建省福州市 350000; 2 福建医科大学药学院

碳量子点(CDs)是利用碳纳米管、碳纤维等大尺寸材料或葡萄糖、柠檬酸等小分子物质为碳源合成的一种粒径在10nm之间的新型碳基纳米材料[1]。近年来,因碳量子点独特的物理结构性质,在生物医学领域引起了较为广泛的关注[2-3]。由于其优异的物理化学性质,如可调的光致发光、相对较高的生物相容性、较低的细胞毒性以及优异的化学惰性,碳量子点在分析检测、活体成像、诊疗剂应用等诸多医用领域逐渐展示应用价值[4-5]。同时,碳量子点逐渐广泛的生物体系应用也引起人们对碳量子点生物安全性的注意。

部分研究发现,具有促细胞生长活性的碳量子点可影响环境动态平衡[6],而且一些高浓度的特定来源碳量子点具有诱导细胞DNA损伤等生物毒性[7-8]。随着碳量子点的广泛应用,由于碳量子点的良好水溶性和环境循环,不可避免地发生部分碳量子点通过生物富集进入生物体内,从而引发机体损伤的风险。因此,不仅需要开展体外细胞安全性评价,更需要进行体内安全性评价的综合工作。目前已有的关于碳量子点的安全性评价存在暴露途径较单一、评价内容不全面、不系统等问题。全面系统地评估碳量子点的生物体内安全性、深入理解材料与生物系统之间的相互作用是决定碳量子点能否实现临床转化的前提和基础。因此,本实验采取两种不同的给药途径开展碳量子点的体内安全性评估,为N-CDs的广泛、深入应用提供初步的免疫安全性评价。希望能够通过系统地分析碳量子点对免疫系统相关重要指标的影响,认识对免疫系统的可能毒理影响,对于进一步开展其在生物医学领域的应用有着重要的研究意义。

1 材料与方法

1.1 试剂与动物 无水柠檬酸、多乙烯多胺购买自阿拉丁试剂有限公司;谷胱甘肽购买自Sigma-Aldrich 公司;丙酮购买自国药集团化学有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-1(IL-1)的检测试剂盒购买自天津安诺瑞康生物技术有限公司。体重为180～200g的SPF级健康SD大鼠64只,雌雄各半,由福建医科大学动物实验中心提供并饲养。动物许可证号:SCXK(闽)2012-0001。

1.2 碳量子点混悬液的制备 氮掺杂碳量子点(N-CDs)的制备方法如下:将含有2.0g柠檬酸(Citric acid,CA)和0.6g谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的混合物置于油浴锅中,加热至140℃并保持此温度直至混合物完全熔化,此时混合物的熔融液体颜色为棕褐色。然后将10ml多乙烯多胺加入熔融混合物中,同时升温至200℃并继续反应1h。将所制备的混合熔融物冷却至室温,加入丙酮溶解产物。6 000r/min离心10min以获得沉淀物,并将沉淀物溶解在超纯水中。最后,用分子量为2 000kDa的透析袋透析纯化72h。

以生理盐水作分散溶剂,将20mg/ml的N-CDs混悬液稀释成不同浓度,配置低(2.5mg/ml)、中(5.0mg/ml)、高(10.0mg/ml)三个剂量组,备用。

1.3 大鼠给药 大鼠适应性喂养1周后,按体重随机分为8组,即仿口服组(空白对照组、N-CDs低、中、高剂量组),尾静脉注射法组(空白对照组、N-CDs低、中、高剂量组),每组8只。

大鼠喂饲普通饲料,自由摄食和饮水,每周称重,按体重调整给药量。仿口服组中,以灌胃方式给药,给药量为10ml/kg,即低剂量组(25mg/kg),中剂量组(50mg/kg)、高剂量组(100mg/kg);尾静脉注射组中以尾静脉注射方式给药,低剂量组(5mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)、高剂量组(20mg/kg)。空白对照组按体重分别给予相应剂量的生理盐水。每日染毒1次,连续染毒8周。

1.4 动物样品采集 末次给药24h后,对大鼠进行颈部采血2ml,将血液用低温高速离心机以5 000r/min离心10min,取血清,置于-80℃冰箱中冷冻保存,备用。取脾、胸腺脏器称重,记录,并称取脾脏约0.3g、胸腺约0.2g,放入研磨机中以60Hz的频率研磨45～60s,制备匀浆,以4 000g离心力离心5min,取上清,放入-80℃冰箱中,待测。

1.5 整体免疫相关标志物检测 根据试剂盒说明,用酶联免疫吸附法(ELISA)对大鼠外周血清中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-1(IL-1),与胸腺、脾组织中的谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)进行检测。TNF-α、IFN-γ和IL-1用于考察碳量子点对大鼠外周血细胞因子的影响;GSH、MDA、SOD的含量变化用于考察碳量子点对于胸腺和脾脏的氧化损伤作用。

2 结果

2.1 N-CDs灌胃对大鼠免疫安全性评价

2.1.1 N-CDs灌胃对大鼠体重的影响。由表1可见,与空白对照组相比,N-CDs不同剂量染毒组的大鼠体重无显著性差异(P>0.05)。与适应期比较,染毒2周后大鼠体重与适应期大鼠的体重明显增加(P<0.05);而染毒3周后大鼠体重进一步增加,体重与适应期大鼠的体重有显著性差异(P<0.01)。

表1 N-CDs灌胃对大鼠体重的影响

2.1.2 N-CDs灌胃对大鼠脾、胸腺脏器系数的影响。由表2可见,N-CDs低、中、高的灌胃剂量分组大鼠的脾、胸腺两个主要免疫器官的脏器系数较空白对照组均未显示出统计学差异。

表2 N-CDs灌胃对大鼠脏器系数的影响

2.1.3 N-CDs灌胃对大鼠脾脏氧化损伤的影响。由表3可见,相较于空白对照组,N-CDs高剂量组使大鼠脾脏的GSH浓度显著下降(P<0.05)。在中剂量下,大鼠脾脏MDA的浓度明显降低(P<0.05),且N-CDs高剂量组下降更为显著(P<0.01)。N-CDs不同剂量染毒组大鼠脾脏的SOD浓度与空白对照组相比,均无显著性差异(P>0.05)。

表3 N-CDs灌胃对大鼠脾脏氧化损伤的影响

2.1.4 N-CDs灌胃对大鼠胸腺氧化损伤的影响。由表4可见,相较于空白对照组,N-CDs各剂量染毒组虽造成GSH、SOD和MDA等指标一定程度降低,但N-CDs各剂量染毒组与空白对照组的氧化损伤指标无显著性差异(P>0.05),均未对大鼠胸腺造成氧化损伤。

表4 N-CDs灌胃对大鼠胸腺氧化损伤的影响

2.1.5 N-CDs灌胃对大鼠外周血细胞因子的影响。由表5可见,在本研究所设的染毒周期和剂量条件下,N-CDs对大鼠的外周血清细胞因子IL-1、IFN-γ、TNF-α浓度均未造成显著性改变(P>0.05)。

表5 N-CDs灌胃对大鼠外周血清细胞因子的影响

2.2 N-CDs尾静脉注射对大鼠免疫安全性评价

2.2.1 N-CDs尾静脉注射对大鼠体重的影响。由表6可见,各染毒组的大鼠体重与空白对照组比较仍未出现明显差异(P>0.05),不同分组之间的体重未见显著性差异且大鼠体重在染毒期间逐渐增长。

表6 N-CDs尾静脉注射对大鼠体重的影响

2.2.2 N-CDs尾静脉注射对大鼠胸腺、脾脏器系数的影响。由表7可见,相较于空白对照组,N-CDs低、中、高剂量组大鼠胸腺的脏器系数均明显下降(P<0.01),而大鼠脾脏的脏器系数明显增大(P<0.01和P<0.05)。

表7 N-CDs尾静脉注射对大鼠脾、胸腺脏器系数的影响

2.2.3 N-CDs尾静脉注射对大鼠胸腺氧化损伤的影响。由表8可见,与空白对照组相比,各剂量组胸腺的GSH和MDA含量均未出现明显改变;然而,胸腺SOD活力随N-CDs尾静脉注剂量的增大而显示出梯度降低,且与空白对照组均具有显著性差异。

表8 N-CDs尾静脉注射对大鼠胸腺氧化损伤的影响

2.2.4 N-CDs尾静脉注射对大鼠脾脏氧化损伤的影响。由表9可见,各剂量组脾脏GSH和SOD含量相较于空白对照组均无显著性差异;而脾脏中、高剂量组的MDA含量相比于空白对照组呈显著性降低(P<0.01和P<0.05)。

表9 N-CDs尾静脉注射对大鼠脾脏氧化损伤的影响

2.2.5 N-CDs尾静脉注射对大鼠外周血细胞因子的影响。由表10可见,各剂量组的TNF-α、IFN-γ和IL-1含量较空白对照组的变化均无统计学差异(P>0.05)。

表10 N-CDs尾静脉注射对大鼠外周血细胞因子的影响

3 讨论

N-CDs同其他纳米材料一样,具有独特的量子尺寸效应及理化性质,且极易进入机体内,引起一系列生物反应。截至目前,国内外现有研究主要关注于其细胞毒性方面,对免疫毒性的研究和阐述较少,且研究结果存在较大争议:部分研究表明碳纳米材料没有明显的毒性作用,而另外的一些研究表明碳纳米材料具有明显的细胞毒性。由于N-CDs的毒性还受环境、人为处理、暴露途径等因素的影响,如果仅采取单个给药途径的实验结论来评价N-CDs免疫毒性的话会存在评价不全面、不系统的问题。因此,本次实验通过灌胃、尾静脉注射的方式进一步、系统地考察N-CDs的免疫安全性。

在本次实验中,分别用灌胃和尾静脉注射方式对大鼠进行N-CDs染毒后,各染毒组的大鼠体重相对空白组无明显差异,且在染毒2周后体重仍明显增长,说明在本次实验设置剂量下大鼠体重未显示出N-CDs的毒性作用。

大量研究表明,通过观察胸腺是否萎缩可用于评价细胞免疫功能的状态,脾淋巴滤泡的萎缩或脾脏重量的减轻则说明机体的体液免疫功能降低。本次实验发现,利用灌胃方式染毒N-CDs的大鼠各个剂量组脾、胸腺的脏器系数几乎与空白对照组一致,说明N-CDs仿口服对大鼠的细胞免疫和体液免疫功能无明显作用。采用尾静脉注射方式染毒的大鼠各个剂量组脾脏和胸腺的脏器系数较空白对照组均发生了明显改变,胸腺系数下降,脾脏系数增大。说明胸腺开始出现了明显的萎缩或退行性改变,而脾脏的增生肥大可能是机体的免疫系统所作出相应的代偿性改变。

免疫细胞的脂质过氧化标志物MDA、GSH和SOD,参与机体的新陈代谢和免疫系统的调控过程,如遇到针对免疫系统的毒性攻击,MDA、GSH和SOD会显示出相应的异常改变。通过检测MDA含量可反映染毒大鼠的脾、胸腺脏器的脂质过氧化程度,GSH和SOD二者的含量则可作为细胞抗氧化水平的评价指标。本次实验发现,灌胃方式给药的大鼠脾脏的组织匀浆中,N-CDs高剂量组的GSH浓度显著降低,表示在N-CDs给药浓度为10.0mg/ml时,大鼠细胞发生氧化反应,处于应激状态,对自由基的清除能力下降,然而染毒组的SOD浓度与空白对照组相比无明显差异,N-CDs中、高剂量组的MDA浓度显著下降,又说明机体脂质过氧化的程度减小。在灌胃方式给药的大鼠胸腺的组织匀浆中,N-CDs染毒组均无明显差异,说明N-CDs未对大鼠的胸腺造成明显的氧化性或者其他损伤。

在对大鼠行尾静脉注射N-CDs后,胸腺的SOD值和脾脏的MDA值均出现了明显下调,表明胸腺所发生的萎缩或退行性改变使得机体清除自由基的能力明显下降,说明静脉注射N-CDs可以引起局部免疫器官发生变化。但是由于机体的免疫系统具有整体性,脾脏的代偿性增大又使得机体脂质过氧化的程度减小,这说明自由基攻击机体细胞的程度可能在免疫系统的自我平衡中得到缓解。

通过检测外周血清中的细胞因子含量可反映机体整体的免疫功能。在此次研究所设剂量下,以灌胃和尾静脉注射方式染毒N-CDs,对大鼠外周血清中的细胞因子IL-1、TNF-α及IFN-γ浓度没有造成显著的变化,说明口服和静脉注射N-CDs均未产生炎症反应,N-CDs对大鼠整体免疫功能的调节作用均无明显影响。

综上所述,N-CDs通过灌胃方式给药进入大鼠机体后,在整体水平上无明显免疫毒性作用,无炎性作用,具有较高的免疫安全性。但灌胃给药在浓度较高时,可导致机体的氧化和抗氧化作用调节紊乱,对免疫系统特别是脾脏造成一定的氧化损伤。尾静脉注射N-CDs对大鼠免疫系统的整体水平上没有明显影响,虽然个别指标出现异常,但免疫系统似乎又表现出自身的免疫调节能力加以维护机体的整体免疫平衡,也证实了N-CDs的免疫安全性。同时,实验结果也说明不同给药途径N-CDs可引起机体不同的局部免疫器官的变化。