犊牛腹泻病因分析及诊断防控综述

罗鹏飞，夏 俊，张 凌，梁纤纤，2，李晓卓，2，郑启铭，2，夏江涛，吕双燕，侯小辉，胡林波，郑汝芸

（1.新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心/农业农村部草食动物疫病防控重点实验室（部省共建），乌鲁木齐 830013；2.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830013；3.新疆阿勒泰地区动物疾病控制与诊断中心，新疆 阿勒泰 836500）

近年来，随着畜牧业高质量发展，养牛业规模不断扩大，犊牛腹泻的发病率呈现上升趋势，不仅导致犊牛大量死亡，还影响愈后犊牛的生长发育和种牛的换代，其中某些病原体还属于人畜共患病原微生物，制约养牛业健康发展的同时还严重威胁公共卫生安全。通过分析临床病例数可知，相比饲养管理不良导致的犊牛腹泻，病原体引起的传染性犊牛腹泻病例数占比超过70%，危害更为严重。因此鉴别检测不同病原体，可以指导合理用药，制定相应的防控措施，对阻断疾病传播和降低养殖场经济损失具有重要的现实意义。

1 犊牛病毒性腹泻相关病原

1.1 病毒引起的腹泻

1.1.1 病毒性腹泻牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVDV）或黏膜病病毒（Mucosal Disease Virus，MDV）引起的接触性传染性疾病[1]，该病毒属于黄病毒科瘟病毒属的单链正股RNA 病毒[1]。BVDV 呈全球分布，可感染猪、牛、羊、鹿以及骆驼等多种家畜和野生动物，引发病毒性腹泻[2]。牛在不同年龄段对BVDV均易感，其致病性和致死率随牛的年龄增长而降低。因此，急性感染常见于6 ～18月龄断奶期犊牛，其临床症状主要表现为腹泻、高热、脱水、白细胞减少等。6月龄以下犊牛感染BVDV临床症状因母体健康状态和感染毒株血清型而有所差异，其中因哺乳获得母源抗体感染不同血清型BVDV的犊牛常表现为亚临床症状，而部分未获得母源抗体保护的新生犊牛发病更严重，除急性肠炎外还可见急性肺炎。此外，孕期通过胎盘感染的胎儿出生后呈BVDV先天持续性感染，机体可不断排出病毒，是BVDV 在牛群中难以根除的重要原因之一，且当其再次感染不同血清型BVDV时，病情发展为“黏膜病”，表现为急性感染症状，一周后该感染犊牛出现急性死亡[3，4]。

1.1.2 牛轮状病毒

牛轮状病毒（Bovine Rotavirus，BRoV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，BRoV主要感染15～90日龄犊牛，尤其是小日龄犊牛[5]。轮状病毒是由11个双链RNA片段组成，编码6种结构蛋白病毒（VP1 ～4、VP6、VP7）和6 种非结构蛋白（NSP1 ～6）[6]。根据中间衣壳蛋白（VP6）的抗体和遗传相似性，可将轮状病毒划分为7 个血清群（A-G）[7]。其中，A 组轮状病毒是家养动物轮状病毒感染的主要原因[8]。犊牛轮状病毒感染腹泻病例通常在1 ～2周龄的新生犊牛中被发现，发病率可达60%～80%，死亡率在0%～50%之间[9]。新生犊牛无并发症的轮状病毒感染腹泻病例死亡率不到10%，但继发肠致病性大肠杆菌或其他肠道病毒感染后死亡率会增加[10]。犊牛在感染BRoV 后12 ～24 h 即可发生急性腹泻，排泄物呈水样黏液状，并伴随呕吐、精神萎靡、食欲减退等症状。感染5 ～7 d后大量病毒会随粪便排出，并感染同舍牛群[11]。

1.1.3 牛冠状病毒

牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BCoV）属于冠状病毒科冠状病毒属，基因组由单链RNA 组成，大小为27 ～32 kb，是目前已知基因组最大的RNA 病毒之一[12]。根据其致病性特点，可分为肠道型BCoV 和呼吸型BCoV，其中引发犊牛腹泻和引发成年牛冬季痢疾的肠道型BCoV 毒株类型又有所不同。致病机制上，当BCoV 感染消化系统时，首先入侵小肠近端，在小肠进行大量复制后蔓延到大肠处。BCoV 在低温潮湿环境中极易繁殖，主要感染30日龄以内的犊牛和成年牛，一般会在感染后7 ～14 d 发生严重腹泻，在空气潮湿或气温较低的季节较易发生[13-16]。感染初期病毒在小肠下半部分绒毛区域的上表皮细胞处进行复制，被感染的肠上皮细胞死亡并脱落，继而被未成熟的肠上皮细胞所取代，导致绒毛发育迟缓及相邻绒毛互相缠结[17]。由于成熟的肠上皮细胞丧失，肠道的消化吸收功能会大幅下降，进而造成犊牛营养不良，降低饲料报酬率。更严重的是随着持续进食，犊牛小肠上皮细胞无法对饲料进行充分消化吸收，未消化的食物会在大肠中发酵，滋生大量的细菌并产生过量的有机酸，进一步加剧犊牛腹泻，并伴有脱水、低血糖以及酸中毒等症状，严重时患病牛可因心力衰竭和急性休克而死亡。

1.1.4 牛诺如病毒

牛诺如病毒（Bovine Norwalk Viruses，BNoV）是一种无包膜的单链正股RNA 病毒，隶属于杯状病毒科诺如病毒属，基因组大小为7.4 ～8.3 kb。由于其高度遗传多样性，根据已开放阅读框ORF 2（VP 1:主要衣壳蛋白）和ORF 3（VP 2:次要衣壳蛋白）的序列相似性确定了五个基因组（G1到GV）[18]。患病牛临床症状表现为腹泻、呕吐、厌食、精神不振和消化不良等[19]。BNoV 高发于秋冬季节，各个年龄段的牛群均易感染，其中初生犊牛易感性最强[20]。BNoV 传染途径广，可以通过粪-口途径从消化道和呼吸道进入机体，且传染能力极强，大约20个病毒粒子就可以引起感染。根据目前流行病学调查结果显示，不同区域牛诺如病毒的感染率差异较大，如英国牛腹泻样本阳性率为11%[21]，美国密歇根州牛腹泻样本中阳性率高达80%[22]，我国6 个省份的牛腹泻样本中阳性率为20.5%[23]，以上表明诺如病毒感染率的高低可能与牛的品种、地域、饲养环境等多种因素相关。

1.2 细菌引起的腹泻

1.2.1 大肠杆菌

大肠杆菌（Escherichia coli）是牛粪便中的一种主要细菌成分，充斥在牛群共生环境中。犊牛大肠杆菌又称犊牛白痢[24]。相关报道称[4]，由致病性大肠杆菌造成的死亡数占新生牛犊死亡总数的28%。根据毒力不同可以将大肠杆菌分为6 个致病群：肠产毒素大肠杆菌（ETEC）、产志贺毒素大肠杆菌（STEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠黏附性大肠杆菌（EAEC）和肠出血性大肠杆菌（EHEC）[25，26]。其中，产肠毒素大肠杆菌（ETEC）可以引发犊牛白痢，又称犊牛大肠杆菌病，新生犊牛在出生后的前4 d 内最易感染。ETEC 体表的K 99（F 5）黏附抗原帮助其定殖于肠绒毛上皮细胞，并产生热稳定性毒素，诱导肠道氯化物分泌上调，增加肠道渗透压，水分通过渗透作用进入肠腔，导致患病牛出现水样腹泻[3]。

1.2.2 产气荚膜梭菌

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种革兰氏阳性、形成孢子的厌氧细菌[27]。根据产生毒素（α、β、ε、ι）的不同可以将其分为5 种毒素型（A—E）[28]。其中C 型是导致犊牛腹泻的主要类型，其主要产生β致病毒素，可直接或间接对肠内皮细胞产生损伤，导致肠壁上出现出血性坏死，先是感染黏膜层，然后会侵袭肠壁的所有层膜[29]。犊牛感染产气荚膜梭菌后通常是亚急性病例发生腹泻，最急性和急性病例无腹泻症状，发病的多为健壮和发育良好的犊牛。患病牛粪样多为酱红色或者黑红色，个别犊牛会排喷射状水样便。患病牛肝脏、脾脏、心肌、心内外膜均有出血，肝脏呈紫黑色，淋巴结肿大呈褐色，出现坏疽。

1.2.3 沙门氏菌

引起犊牛腹泻的沙门氏菌（S.typhimurium）主要有鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和都柏林沙门氏菌（Salmonella dublin）两种[30]。10 ～90 日龄的犊牛易感，成年牛抵抗力较强。临床表现以水样和黏液样腹泻为主，在腹泻物中会伴有特征性纤维蛋白和血液[31]。急性腹泻最常见于鼠伤寒沙门氏菌感染，全身性疾病常见于都柏林沙门氏菌感染。在被感染的小牛肠道还经常观察到小肠假膜炎症以及肠系膜淋巴结肿大等病变。沙门氏菌也是一种人畜共患病病原，牛源沙门氏菌可以通过餐饮链或直接接触将病原传播给人，威胁公共卫生安全。

1.3 寄生虫引起的腹泻

1.3.1 隐孢子虫

隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是一种胃肠道中常见的原生生物病原体，感染奶牛和免疫较弱的犊牛后可以引发隐孢子虫病，是全球犊牛腹泻的主要原因[32]。隐孢子虫主要通过粪-口途径传播，引发犊牛急性腹泻。隐孢子虫的生命周期包括滋养体、分裂体、配子体、受精卵和卵囊五个阶段，其中卵囊为感染阶段。隐孢子虫生命力顽强，可以在环境中存活1个月[33]。隐孢子虫被牛摄入体内后，卵囊释放出的孢子体穿入小肠细胞，通过无性生殖和有性生殖两种方式产生大量大孢子体和小孢子体。大孢子体和小孢子体完成授精发育成孢子，产生的薄壁卵囊留在体内进行自体感染，厚壁卵囊排出体外继续侵染其他个体。隐孢子虫侵染肠上皮细胞后，类似牛冠状病毒感染，犊牛的小肠细胞骨架结构发生改变引发肠绒毛萎缩，导致犊牛小肠的消化吸收能力下降，降低饲料报酬率，并引起肠道积食和食物发酵，对机体造成不良影响。

1.3.2 球虫

球虫（Coccidia)隶属于原生动物界（Protozoa），其艾美尔科（Eimeridea）多个属的病原体可引起家畜球虫病，给畜牧业造成巨大经济损失[34]。相关文献记载中可感染牛的艾美尔属球虫包括阿拉巴艾美尔球虫（E. alabamensis）（Christensen，1941）、牛艾美尔球虫（E. bovis）、加拿大艾美尔球虫（E.canadensis）、邱氏艾美尔球虫（E.zuernii）等10余种[34]。各品种不同年龄段的牛均易感，其中6月龄内的犊牛发病率最高，冬季寒冷时在饲养管理欠佳的奶牛场易感染球虫[12]。艾美尔属球虫感染多发生在夏秋季及潮湿的雨季，犊牛误食球虫卵囊后，卵囊通过消化道进入体内，潜伏期为2 ～3 周，多为急性发病，病程可持续15 d 左右，常引起食欲不振、腹泻，并且粪便带有一些稀薄的血液，继而变为排黑色粪便。犊牛发病后期粪便全部带血、体温下降、极度消瘦、贫血、治疗不及时易导致衰竭而死。临床病变主要包括结肠中出现红色水样内容物以及粗糙颗粒状发红的结肠黏膜，伴有瘀点出血和肠壁水肿。

2 诊断方法

2.1 临床诊断法

引起犊牛腹泻的病原复杂，受病因差异的影响，犊牛在患上腹泻后的症状表现会出现不同程度的差异。表1主要对不同致病原对应的临床症状，以及易感染犊牛的日龄特征进行了梳理[35，36]。

表1 不同致病原对应的犊牛腹泻临床症状

2.2 实验诊断法

2.2.1 免疫学方法

ELISA技术是利用抗体对靶抗原的识别来快速检测临床样本中的病原体的常用免疫学方法，具有成本低、特异性强、灵敏度高等优点[37]。ELISA 所用的抗体通常附着在玻璃、塑料或膜过滤器等固体表面，利用抗体捕获样本中存在的目标抗原，最后利用比色反应验证被捕获抗原，并指示抗原-抗体反应。

ELISA 技术已在诊断医学领域得到应用。商用Ag-ELISA 试剂盒可用于检测粪便样本中的BRoV、BCoV 和隐孢子虫等病原体。采集高质量的样本对于获得可靠的检测结果非常重要，应采集急性感染犊牛的新鲜粪便，以便获得最佳检测数据。

2.2.2 分子生物学方法

PCR 技术是检测犊牛腹泻病原体常用的分子生物学方法。该法首先需要提取目标病原体的基因组，之后将样品与热稳定的DNA 聚合酶（例如Taq DNA 聚合酶）、dNTP、引物和PCR 缓冲液混合，在自动热循环仪中进行25 ～40 个扩增循环[38]。反应完成后，进行电泳、上样，DNA 经过溴化乙锭染色后，PCR产物可以在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上显现，根据扩增片段的大小和有无，对病原体进行检测和识别。

PCR检测技术适用于细胞培养物中难以分离的病毒或需要长时间生长的细菌，PCR检测技术具有操作简便、灵敏度高和速度快等优点。但由于其高灵敏度，现场采样或实验室处理过程中需要注意假阳性结果的出现。此外，对于具有高突变率的RNA 病毒（如轮状病毒），还需要持续监测毒株变异情况，确定流行优势基因型。

2.2.3 电镜

电子显微镜可以从形态特征上对病毒进行检测和鉴定。目前应用于病原检测的电镜技术主要分为两种：直接电镜（EM）和免疫电镜（IEM）[39]。大多数导致犊牛腹泻的病毒如BNoV、BRoV、BCoV等很难在细胞中分离和繁殖，但这些病毒利用EM 技术能实现可视化，利用病毒独特的形态进行区分和鉴定[40]。但是EM 技术也具有弊端，在病毒检测时灵敏度较低，样本需要含有大量的病毒颗粒（104～106个病毒颗粒/mL），并且不能同时检测多个样本[41]。相较而言，IEM 技术的检出率要高得多，IEM技术的灵敏度比EM高10倍以上，更容易捕捉到特定病原。

从患病犊牛身上准确采集粪便样本对电镜检测鉴定是否成功至关重要。虽然电镜检测鉴定可以检测不明感染原因引起的犊牛腹泻，但电子显微镜的高成本和对实验室操作人员的高熟练度要求，限制了EM的普及。

2.2.4 基因芯片

基因芯片技术是多种学科交叉渗透的高新生物技术，它融合了生命科学、化学、微电子学、计算机科学、统计学和生物信息学等诸多学科领域的成就，具有快速、高效、大规模、高容量、高度并行性的特点[42]。基因芯片技术将大量已知序列的寡核苷酸致密有序的固定在各种载体的表面，形成DNA微阵列，之后与带有荧光标记的待测核酸样品进行杂交，对杂交信号进行扫描以及计算机检测分析后，可以提高临床样本中病原体的检出效率。据报道，基因芯片技术在一些轮状病毒的鉴定和分群研究中得到使用[43，44]，但是因为技术成本高、仪器设备限制等因素目前尚未普及，主要在部分科研院所动物疫病检测中应用该技术。

3 综合防控

诱发犊牛腹泻的因素有多种，主要可以概括为犊牛免疫力较弱，易感腹泻相关病原体和围产期育犊环境差，饲养管理水平跟不上两类。在养殖生产过程中，养殖场要充分做好重要环节的生物安全防控措施，病畜及时隔离治疗，提高育犊区饲养条件，方能减少犊牛腹泻的发病机率，从根本上遏制病原体传播。

3.1 提高犊牛免疫力

新生犊牛由于免疫系统尚未完全发育，最容易受到环境中病原体的感染。母牛初乳中含有大量可以抵御病菌的抗体和免疫细胞，对增强新生犊牛抵抗力非常关键，所以要及时为新生犊牛提供足量的初乳。在犊牛的发育过程中，要保证母牛产乳量满足犊牛的生长需要，避免因为母乳摄入不足而导致犊牛免疫力低下。

3.2 保障犊牛良好的生活环境

犊牛受环境因素变化容易产生应激反应，如大风、低温、高湿度等因素都可能引起犊牛产生应激，增加犊牛腹泻发病概率[45]。因此，要保障犊牛生长的环境适宜且相对稳定，避免环境温度过冷或过热，或者通过人工控制育种时间，将产犊时间设定在本地气候相对稳定的季节。环境污浊是引发犊牛腹泻的主要原因，应保证犊牛生存环境干燥通风，温度相对稳定，定期清理粪便，并要及时消毒。对于染病犊牛，应做好隔离处理，避免病菌在牛群中扩散。

3.3 注重围产期产仔管理

母牛的营养状况直接关系到犊牛生长发育和免疫力提高[46，47]。母牛摄入的营养不足，容易导致牛奶产量下降和乳汁免疫球蛋白下降等情况，小牛生长所需的牛乳不能得到保障，营养摄入缺失，免疫能力下降，犊牛腹泻发生几率增加。因此，在母牛妊娠期和哺乳期，需要保证母牛摄入充足的营养。此外，母牛在分娩阶段比较敏感，疾病感染风险增加，注重围产期饲养管理，可降低如BVDV 等垂直传播疾病的发生概率。

4 讨 论

犊牛腹泻是影响犊牛健康生长最严重的疾病之一，约占新生小牛发病率的80%，是导致世界各地养牛业发展受制和效益下降的主要原因。引起犊牛腹泻发病的原因复杂，临床表现多样，养殖从业主体要在掌握典型症状及其对应的致病原因基础上，采取相应的鉴别方法加以诊断。虽然目前针对犊牛腹泻的检测手段和防控措施都有很大的进展，但仍存在较多问题。比如，在检测技术上，应用病毒分离可确认临床标本中存在的传染性病毒，但缺点是低灵敏度，受培养细胞特性的限制，须达到正确收集和保证病毒生存能力的要求；应用电子显微镜技术虽然形态学可视化，但样品中需要大量病毒颗粒；在防控措施上，因管理不当、环境卫生差、免疫措施不到位等均可引起犊牛腹泻。因此，在养殖生产中防控犊牛腹泻应以预防为主，要特别注意犊牛的防寒保暖、牛舍和用具的消毒、母牛的饲养管理、免疫流程的规划以及流行病的预防等综合措施。对受感染的犊牛应积极隔离、治疗，通过防控和治疗相互结合，从源头上控制犊牛腹泻，避免造成经济损失。