裂褶菌高产菌丝体发酵培养基的优化

孙 畅, 宋鹏炜, 李翘楚, 王红艳

(中国农业大学 烟台研究院, 山东 烟台 264670)

0 引言

【研究意义】裂褶菌(Schizophyllumcommune)又称白参、树花和鸡毛菌等,隶属于真菌门担子菌纲伞菌目裂褶菌科裂褶菌属(Schizophyllum),是一种珍贵的药食两用菌[1-2]。裂褶菌为木腐菌,自然状态下一般于春秋季生于阔叶树及针叶树的枯枝及腐木上,广泛分布于世界各地,在我国主要分布于河北、黑龙江、辽宁、内蒙古及云南等20余个省(区、市)。裂褶菌子实体不仅味道鲜美,且富含蛋白质、免疫性多糖、多种人体必需氨基酸和微量元素[3-6],具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗炎症及抗疲劳等多种功效,尤其是裂褶菌多糖因具有药用和保健价值而成为研究热点[7-10]。裂褶菌已经实现人工栽培,但仍存在生产周期长、生物转化率低、栽培规模小、产量及品质不稳定等问题,导致其活性产物的开发利用受到限制。因此,提高裂褶菌菌丝体产量对于其活性产物的开发利用具有重要意义。【前人研究进展】液体发酵技术是获得裂褶菌菌丝体和发酵产物的重要手段,此方式具有生产周期短、不受季节和地域的限制、成本低等优势,因此探索裂褶菌液体发酵条件可为规模化的菌丝体生产及活性产物的开发利用提供技术支持。目前,国内对裂褶菌液体发酵的研究已有少量报道[11-15],冀颐之等[13]研究确定裂褶菌产糖的最优培养基配方为葡萄糖45 g/L、酵母膏3 g/L、 KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L,在此条件下裂褶菌菌丝体最大得率为20.75 g/L;邴雪等[14]研究表明,当培养基碳源为玉米淀粉,氮源为酵母浸粉,pH 4时,发酵液中裂褶菌素的产量最高,达2.13 mg/mL。【研究切入点】已有研究均以胞外多糖产量为指标对培养基成分或培养条件进行优化,而有关培养基配方对菌丝体产量影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用摇瓶培养和正交试验方法,以菌丝体产量为筛选指标,对1株野生裂褶菌的液体发酵培养基重要碳源、氮源及生长因子进行优化,探索液体发酵条件对该裂褶菌菌丝体生长的影响,以期为菌丝体的批量生产及其胞内活性产物开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 裂褶菌菌株 为野生菌株,由中国农业大学烟台研究院分离保存。

1.1.2 培养基

1) 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。马铃薯200 g、葡萄糖20 g及水1 000 mL,pH自然。

2) 种子培养基。土豆浸粉 8 g、蛋白胨 2 g、葡萄糖 20 g、牛肉膏 2 g、酵母膏 2 g、MgSO4·7H2O 1 g及KH2PO42 g及水1 000 mL,pH 6.0。

3) 基础发酵培养基(g/L)。葡萄糖 20 g、酵母膏 6 g、VB10.001 g、MgSO4·7H2O 1 g及KH2PO42 g,水1 000 mL,pH 6.0。

1.1.3 主要仪器与设备 CR21GⅢ冷冻离心机,Hitachi Koki公司;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;高压蒸汽灭菌器,上海申安医疗器械厂;电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;SFY-10L发酵罐,镇江市江大科技有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 种子液的制备 将裂褶菌菌种接种到PDA平板上,25 ℃培养3～5 d。用直径1 cm的打孔器,打取4个菌丝块,接种到装液量为150 mL/250 mL的种子培养基中,于25 ℃、160 r/min条件下培养5 d。按5%接种量接种于新的种子培养基中,于25 ℃、160 r/min条件下培养5 d即得到新鲜的种子液。

1.2.2 最适碳源、氮源及生长因子的筛选 取种子液以5%的接种量接种于碳源、氮源和生长因子筛选培养基中,于25 ℃、160 r/min条件下培养7 d,以菌丝体干质量为考察指标筛选最适碳源、氮源及生长因子。菌丝体产量测定:将发酵液6 000 r/min离心10 min,取沉淀,用蒸馏水洗涤3次,放置50 ℃烘箱中烘干至恒重,然后称重即得。

1) 碳源。设4个处理,在基础发酵培养基其他原料不变的情况下,改变培养基中的碳源(葡萄糖)分别为淀粉、蔗糖、麦芽糖及乳糖,质量浓度20 g/L;以基础发酵培养基为对照(CK),下同。

2) 氮源。设4个处理,在基础发酵培养基其他原料不变的情况下,改变氮源(土豆浸粉)分别为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏及大豆蛋白胨,质量浓度6 g/L。

3) 生长因子。设4个处理,参照文献[16]的方法,在基础发酵培养基其他原料不变的情况下,改变生长因子(VB1)分别为油酸、L-谷氨酸、α-萘乙酸及3-吲哚丁酸,质量浓度1 mg/L。

1.2.3 单因素试验 在确定最佳碳源、氮源及生长因子基础上,以菌丝干质量为考察指标分别对其最适浓度进行筛选。

1) 碳源。设5个处理(Z1～Z5),分别为10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L。

2) 氮源。设5个处理(B1～B5),分别为4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L和12 g/L。

3) 生长因子。设5个处理(L1～L6),分别为0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L和3.0 mg/L。250 mL培养瓶的装液量为150 mL,于25 ℃、160 r/min条件下培养5 d,分别测定其菌丝体的干质量。

1.2.4 正交试验优化裂褶菌菌丝体发酵培养基 在单因素试验的基础上,以蔗糖〔A(g/L)〕、牛肉膏〔B(g/L)〕和L-谷氨酸〔C(mg/L)〕为试验主要因素,通过L9(34)正交试验(表1)优化高产菌丝体发酵培养基配方。

表1 L9(34)正交试验优化裂褶菌菌丝体发酵培养基的因子与水平

2 结果与分析

2.1 不同碳源、氮源与生长因子处理菌丝体的产量

由图1可知,不同碳源、氮源与生长因子对裂褶菌菌丝体产量的影响存在差异。

2.1.1 碳源 不同碳源处理裂褶菌菌丝体产量为6.76～12.22 g/L,依次为蔗糖>麦芽糖>葡萄糖>淀粉>乳糖,各因素间存在较大差异。其中,乳糖显著低于其余碳源,淀粉显著低于其余碳源;葡萄糖和麦芽糖作为碳源时菌丝体产量无显著差异;以蔗糖为碳源时菌丝体产量显著高于其余碳源,故蔗糖为最佳碳源。

2.1.2 氮源 不同氮源处理菌丝体产量为11.52～13.43 g/L,依次为牛肉膏>蛋白胨>酵母膏>大豆蛋白胨>土豆浸粉。其中,土豆浸粉显著低于其余氮源,蛋白胨、酵母膏和大豆蛋白胨三者之间无显著差异;牛肉膏显著高于其余氮源,故牛肉膏为最佳氮源。

注：图柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.1.3 生长因子 不同生长因子处理菌丝体产量为11.79～12.52 g/L,依次为L-谷氨酸>3-吲哚丁酸>α-萘乙酸>VB1>油酸。其中,VB1、α-萘乙酸和油酸间无显著差异,但均显著低于其余生长因子;3-吲哚丁酸显著低于L-谷氨酸;L-谷氨酸显著高于其余生长因子,故L-谷氨酸为最佳生长因子。

2.2 不同因素处理菌丝体的产量

由图2可知,裂褶菌菌丝体产量均随不同因素浓度增加呈先增后降趋势。

图2 不同因素处理裂褶菌菌丝体的产量

2.2.1 蔗糖 不同浓度蔗糖处理裂褶菌菌丝体产量为9.70～19.56 g/L,依次为Z4>Z5>Z3>Z2>Z1。Z4菌丝体产量最高;蔗糖浓度继续增加,菌丝体产量反而减少。说明,适当增加蔗糖浓度有助于菌丝体生长,而蔗糖浓度过高则会抑制菌丝体生长。因此,确定蔗糖浓度30 g/L、40 g/L和50 g/L为高产菌丝体正交试验中碳源的3个水平。

2.2.2 牛肉膏 不同浓度牛肉膏处理裂褶菌菌丝体产量为10.63～14.53 g/L,依次为B3>B4>B2>B5>B1。牛肉膏浓度小于8 g/L时菌丝体产量随牛肉膏浓度增加而增加;B3(牛肉膏浓度为8 g/L时)菌丝体产量达最大;牛肉膏浓度超过8 g/L菌丝体产量随牛肉膏浓度增加而降低。因此,确定牛肉膏浓度6 g/L、8 g/L、10 g/L为高产菌丝体正交试验中氮源的3个水平。

2.2.3 L-谷氨酸 不同浓度L-谷氨酸处理裂褶菌菌丝体产量为9.27～9.78 g/L,依次为L5>L4>L3>L2>L1>L6。当L-谷氨酸浓度为0.5～1.5 mg/L时,菌丝体产量随L-谷氨酸浓度增加而缓慢增加;当L-谷氨酸浓度超过1.5 mg/L时,菌丝体产量呈明显增加;当L-谷氨酸浓度为2.5 mg/L时,菌丝体产量达最大;之后浓度继续增加,则菌丝体产量呈下降趋势。因此,确定1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L为高产菌丝体正交试验中生长因子的3个水平。

2.3 正交试验优化裂褶菌菌丝体发酵培养基组合

L9(34)正交试验结果(表2～4)表明,各处理菌丝体产量为10.05～20.86 g/L,依次为T8>T9>T7>T5>T6>T4>T3>T2>T1,T8(A3B2C1)菌丝体产量最高,T9其次。从K值看出,最优培养基组合为A3B2C2,即蔗糖50 g/L、牛肉膏8 g/L、L-谷氨酸2 mg/L。进一步对正交试验结果进行方差分析和F检验表明,因素A和因素B对裂褶菌菌丝体产量的影响差异显著,而因素C对菌丝体产量的影响差异不显著,校正模型整体具有显著性。

表2 裂褶菌菌丝体发酵培养基正交试验结果

表3 L9(34)正交试验的均值、极差与最优组合

表4 正交试验方差分析

由于根据K值分析得到的最优组合A3B2C2不在正交试验设计中,对于其实际生产效果进行验证(3次重复)试验,结果表明,利用优化后的培养基,种子液以5%的接种量,250 mL培养瓶装液量为150 mL,于25 ℃、160 r/min条件下培养7 d,菌丝体产量达21.51 g/L,是基础培养基上菌丝体产量(10.55 g/L)的2.03倍,较正交试验最佳处理T8提高3.1%。

3 讨论

目前,裂褶菌液体发酵研究以提高胞外多糖得率为主,提高菌丝体产量以及菌丝体营养方面的研究相对较少。马布平等[17-18]对裂褶菌培养基进行了筛选,但尚未就裂褶菌菌丝生长需要的营养条件进行探究。邴雪等[14]研究表明,裂褶菌最佳碳源和氮源分别为玉米淀粉和酵母浸粉;周莹等[19]研究认为,可溶性淀粉和黄豆粉分别为最佳碳、氮源。孙金旭等[20]研究显示,裂褶菌菌丝体最适的生长因子为油酸。本研究结果显示,裂褶菌最适的碳源、氮源和生长因子分别是蔗糖、牛肉膏和L-谷氨酸。不同研究得出的结论并不一致,其原因可能是研究者选取的裂褶菌菌种不同,或试验时所选取的营养物质种类不同导致。

裂褶菌菌丝体含有丰富的多糖等活性物质,其胞内多糖分子量大于胞外多糖[21-22],且具有胞外多糖没有的生物活性[23]。研究结果表明,最优培养基组合为蔗糖50 g/L+牛肉膏8 g/L+L-谷氨酸2 mg/L+MgSO4·7H2O 1 g/L+KH2PO42 g/L,pH 6.0,利用此培养基,种子液以5%的接种量,250 mL培养瓶装液量为150 mL,于25 ℃、160 r/min条件下培养7 d,菌丝体产量达21.51 g/L,是基础培养基产菌丝体(10.55 g/L)的2.03倍,较正交试验最佳组合A3B2C1提高3.1%。研究结果为裂褶菌胞内活性产物的工业化生产和开发利用提供了一定技术支持,但研究仅对高产菌丝体培养基的主要成分进行了优化,今后还需从其他培养基成分、培养条件及代谢产物的积累等方面开展进一步研究。

4 结论

采用摇瓶培养、单因素试验和正交试验方法探究1株野生裂褶菌高产菌丝体液体发酵培养基配方,对发酵培养基中的碳源、氮源及生长因子进行优化,筛选出最佳发酵培养基(蔗糖50 g/L+牛肉膏8 g/L+L-谷氨酸2 mg/L+MgSO4·7H2O 1 g/L+KH2PO42 g/L,pH 6.0),其裂褶菌菌丝体产量达21.51 g/L,是基础培养基上菌丝体产量的2.03倍。