地衣芽孢杆菌FZ1对发酵雪茄烟叶中性致香成分的影响

赵晓超, 李林林, 张贝贝, 谭再钰, 周亚彬, 吴 创, 禹 言,张静亚, 瞿 欢, 普 倩, 黄友谊, 潘 勇*

(1.湖北中烟工业有限责任公司,湖北 武汉 430040; 2.华中农业大学 生命科学技术学院, 湖北 武汉 430070; 3.华中农业大学 园艺林学学院, 湖北 武汉 430070)

0 引言

【研究意义】烟叶发酵是从农产品原料到雪茄产品的重要环节,是提高烟叶质量、改善雪茄香吃味的重要步骤[1]。人工接种发酵为雪茄烟叶的工业化生产提供了更高效和更高品质的解决方案。因此,加快菌种资源的挖掘和探究对雪茄烟叶品质影响,对促进产业高速发展具有重要意义。【前人研究进展】在微生物发酵作用下,烟叶内部无特征香味大分子化合物转化分解为各种小分子或挥发性物质,形成烟叶特定品质风味,中性致香成分含量是客观评价烟叶品质的重要标准[2-3]。经过烟叶发酵,烟叶的香气、吃味和外观得到明显改善,燃烧性提高,霉变率显著降低[4]。选育优良菌种发酵烟叶提升烟叶质量,已成为当前的研究热点[5-7];而当前国内对烟叶优良菌株的选育正处于起步阶段,尚未建立起适合发酵生产雪茄烟叶的微生物技术体系[8]。【研究切入点】通常进口雪茄烟支品质优于国产雪茄是其优势菌发挥了重要作用,前期从进口雪茄烟支中分离到1株优势菌地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)FZ1,是常用于食物发酵的有益菌,呈现辛香、蜂蜜香、醋酸香和酱香等特征性香气[9],在烟叶发酵中的相关研究较少,为此,将其用于雪茄烟叶发酵,分析其对雪茄烟叶中性致香成分的影响。【拟解决的关键问题】通过人工接种发酵获得更高品质的烟叶,明晰FZ1对烟叶中性致香成分的影响,为人工接菌发酵雪茄烟叶提供菌种资源和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)FZ1是由华中农业大学微生物工程实验室分离自多米尼加进口富恩特OPUS X(父与子)雪茄烟中的1株优势菌。

1.1.2 雪茄 发酵的雪茄烟叶由湖北中烟工业有限责任公司提供,雪茄烟叶品种为Criollo 98,叶位是上二棚。

1.1.3 试剂 乙酸苯乙酯(98%)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;C7-C40正构烷烃混标为色谱纯(BR),购于上海安谱实验科技股份有限公司。

1.1.4 培养基 牛肉浸膏蛋白胨培养基(g/L):牛肉膏5.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0,pH 7.0～7.2,固体培养基再加琼脂粉20.0。

1.2 优势菌株FZ1发酵雪茄烟叶

1.2.1 菌种制备 FZ1菌株接种至牛肉膏液体培养基,于37 ℃、180 r/min振荡培养12 h。然后以4 000 r/min离心5 min,收集菌体。菌体用无菌水清洗2次,无菌水重悬得菌液,进行计数,配制成一定菌浓度的菌液,作为接种备用。

1.2.2 发酵雪茄烟叶 挑取完整片状雪茄烟叶原料,每份约40 g。将FZ1菌株菌液直接均匀喷洒至雪茄烟叶表面,至接种量为108CFU/g烟叶,再用无菌水将雪茄烟叶含水率调至为40%,以仅添加无菌水至含水率40%的烟叶作对照(CK),每组设置3个重复。将接种后的烟叶装于无菌袋中,密封,于37 ℃恒温发酵15 d,取出发酵烟叶进行分析。

1.2.3 雪茄烟叶含水率的测定 雪茄烟叶含水率参考标准YC/T 31—1996烘箱法测定[10]。

1.3 发酵雪茄烟叶的感官评价

由6名专家评委对发酵后的雪茄烟叶进行感官评价,评价指标包括烟叶香气、刺激性、色泽,各指标按档次分别赋予不同分值,满分依次为15分、15分和10分(表1)。

表1 雪茄烟叶感官质量各单项指标记分

1.4 雪茄烟叶中性致香成分测定

雪茄烟叶中性致香成分使用水蒸气蒸馏-二氯甲烷溶剂萃取法测定[11]。将发酵后的烟叶剪切,再用植物粉碎机粉碎,过40目筛,低温保存备用。在1 000 mL圆底烧瓶中加入5.0 g烟叶样品、0.5 g柠檬酸、500 mL蒸馏水和50 μL乙酸苯乙酯内标(2.226 μg/μL),使用恒温电热套进行加热;装置的另一端接盛有40 mL二氯甲烷的250 mL圆底烧瓶,该烧瓶置于恒温水浴锅中加热,水浴温度为60 ℃。同时蒸馏萃取2.5 h。萃取完成后,加入过量无水硫酸钠干燥有机相,将有机相转移到茄形瓶,然后使用旋转蒸发仪浓缩至1 mL即得烟叶精油,转移至2 mL棕色气相瓶中,用于GC-MS分析。

色谱柱:TG-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。载气He,流速1.0 mL/min;进样口温度250 ℃,传输线温度280 ℃。离子源温度177 ℃。升温程序:初始温度60 ℃,保留2 min;然后以2 ℃/min的升温速度升至230 ℃,保留15 min。分流比10︰1,进样量为2 μL,电离能70 eV,电离方式EI。质量数为35～500 amu,溶剂延迟6 min。

挥发物由美国国家标准技术研究所(NIST)质谱数据库和保留指数(RI,由正构烷烃C7-C40测定)表征。挥发物相对含量计算公式:

1.5 数据处理

所有鉴定的中性致香成分利用SIMCA(version 14.1, Umetries, Sweden)进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA),利用变量投影重要度(Variable Importance in Projection, VIP)>1和独立t检验中P<0.05筛选显著变化的物质作为差异代谢物。差异中性致香成分含量采用Z-score归一化处理并作热图。关键中性致香成分采用相对香气活力值(Relative Odor Activity Value, ROAV)进行比较,阈值查询采用文献[12]提供的空气介质觉察阈值,优先使用最新年份的阈值数据。一般认为,ROAV>1的组分为关键香气成分,0.1

2 结果与分析

2.1 地衣芽孢杆菌FZ1发酵雪茄烟叶感官评价

如表2所示,FZ1发酵后得分明显高于CK,CK烟叶香气整体特征表现有明显的刺激性,香气较弱,FZ1发酵后雪茄烟叶刺激性明显降低,香气饱满甜度增加,色泽略低于CK,最终感官得分较CK高2.0分,说明FZ1发酵后雪茄烟叶的整体感官品质有所提升。

表2 雪茄烟叶感官质量评分

2.2 地衣芽孢杆菌FZ1发酵雪茄烟叶中性致香成分组成

由表3可见,从FZ1菌株发酵样及CK样中分别检测出中性致香成分35种和39种,将各中性致香成分相对含量进行Z-score归一化处理并作热图(图1),按官能团可分为烯烃类、醛类、醇类、酮类、酯类和酚类6大类中性致香成分(图2)。CK烟叶中性致香成分总量为1 118.28 μg/g,有烯烃类8种(26.18%)、酮类14种(26.02%)、酯类3种(17.19%)、醇类8种(20.59%)、醛类4种(6.21%)、酚类2种(3.81%);FZ1发酵烟叶中性致香成分总量为1 328.99 μg/g,有烯烃类6种(28.59%)、酮类14种(28.70%)、醇类9种(24.70%)、酯类2种(13.02%)、酚类1种(4.06%)、醛类3种(0.92%)。与CK相比,接种FZ1发酵后酮类、醇类、烯烃类、酚类的致香成分含量分别增加2.68%、4.11%、2.42%和0.26%,叶绿素降解产物新植二烯含量也增加27.74%;新植二烯可充当其他致香物质的载体,减轻烟气对咽喉的直接刺激性[14]。香叶基丙酮、金合欢基丙酮、二氢猕猴桃内酯、2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、异佛尔酮和巨豆三烯酮B等6种类胡萝卜素降解产物在FZ1发酵后,含量分别提高267.20%、13.31%、173.87%、292.77%、224.10%和61.05%;香叶基丙酮具有浓郁果香味,可增加烟气香气;金合欢基丙酮具有清甜、坚果香;少量二氢猕猴桃内酯能减少刺激性、增加清新感;2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮具有干香,能使烟气和顺并减少刺激性;巨豆三烯酮能增加烟叶中的干香和甜润感[15-17];表明FZ1发酵可以有效转化和降解烟叶中的类胡萝卜素,这对雪茄烟叶香气风格的形成具有重要影响[18]。FZ1发酵后,烟叶中西柏烷类降解物茄酮含量增加32.46%,而茄酮具有类似胡萝卜的香味以及甘草、茶样芳香,在增香提质、醇和烟气等方面有十分显著的作用[19]。FZ1发酵后植物醇含量提高39.12%,为中性致香成分中含量最高的成分,具有很弱的花香和香脂香气,常作为定香剂用于烟用香精[20]。FZ1发酵后雪茄烟叶中共新增3种致香成分,分别为具有青草香、柑桔样的香气的6-甲基-5-庚烯-2-酮、具有花香的(S)-氧化芳樟醇和有较弱花香和木香香调的香叶基芳樟醇,这些致香成分可赋予雪茄烟叶干香、花香和清甜感,明显提高其嗅香。此外,FZ1发酵后雪茄烟叶中共有7种致香成分未被检测出,分别为4-(2,2,6-三甲基环己基)-2-丁酮、里那醇、苯乙醛、2,6二甲基壬烷、正十五烷、邻苯二甲酸二丁酯和2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚。

图1 雪茄烟叶中性致香成分热图

图2 雪茄烟叶中性致香成分种类含量

表3 雪茄烟叶中性致香成分含量

2.3 地衣芽孢杆菌FZ1发酵雪茄烟叶差异中性致香成分

从PCA散点图(图3A)可看出,FZ1和CK之间存在显著差异(P<0.05),但组内差异不显著(P>0.05)。对于相关性较小的变量根据OPLS-DA模型进行分析(图3B),结合独立样本t检验,以VIP>1.0和P<0.05为标准筛选差异性致香成分,进一步展示组间差异(表4)。

图3 雪茄烟叶中性致香成分主成分分析图和正交偏最小二乘法判别分析图

结合OPLS-DA分析结果共筛选15种差异中性致香成分,包括5种酮类(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、2,6,6-三甲基-1,4-环己二酮、茄酮、香叶基丙酮、金合欢基丙酮),醇类有香叶基芳香醇和植物醇,醛类有苯乙醛,酚类有2,4-二叔丁基苯酚和2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚,烯烃类有新植二烯、正十五烷和正二十七烷,酯类有邻苯二甲酸二丁酯和(R)-二氢猕猴桃内酯。将差异中性致香成分进行相对含量Z-score归一化处理并作热图(图4);FZ1发酵雪茄烟叶后显著增加的差异中性致香成分共有11种,分别为新植二烯、植物醇、2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、2,6,6-三甲基-1, 4-环己二酮、茄酮、金合欢基丙酮、香叶基丙酮、2,4-二叔丁基苯酚、正二十七烷、香叶基芳樟醇和(R)-二氢猕猴桃内酯(P<0.05);显著下降的差异中性致香成分有正十五烷、苯乙醛、2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚和邻苯二甲酸二丁酯(P<0.05)。

2.4 地衣芽孢杆菌FZ1发酵雪茄烟叶关键中性致香成分

由图5可见,在15种差异致香成分中,有10种与雪茄烟叶的香气得分呈正相关,其中,新植二烯、茄酮、金合欢基丙酮、植物醇、香叶基丙酮和2,4-二叔丁基苯酚与烟叶的整体香气呈显著或极显著正相关关系,这与前人的研究结果一致[21-23];共有4种成分与香气呈负相关关系,其中,苯乙醛与烟叶的整体香气呈极显著负相关关系,这与王鹏泽等[24]的研究结果相似,苯乙醛具有浓郁的花香,但对烟草干香和焦甜香有较大负面影响。有5种成分与雪茄烟叶刺激性呈正相关关系,其中,苯乙醛和2,4-二叔丁基-6-硝基苯酚呈显著相关;有10种成分与雪茄烟叶刺激性负正相关关系,其中,新植二烯呈极显著负相关关系,茄酮呈显著负相关关系。尽管有4种成分与雪茄烟叶色泽呈正相关关系,11种成分呈负相关关系,但均不显著(P>0.05)。综合可知,新植二烯、2,4-二叔丁基苯酚、金合欢基丙酮、茄酮、植物醇和香叶基丙酮可被认为是FZ1发酵雪茄烟叶后的关键差异中性致香成分。

注：*和**分别表示差异达显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平。

2.5 地衣芽孢杆菌FZ1发酵雪茄烟叶中性致香成分的香气贡献

从表5可知,未接菌发酵雪茄烟叶共有12种主要致香成分(ROAV>1),其中,有9种ROAV>10的关键赋香成分,包括具有干草香的2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮(100.00),有青甜香、玫瑰香的香叶基丙酮(44.53),有干果香的巨豆三烯酮A(42.16)和巨豆三烯酮B(30.11),有风信子香、果香的苯乙醛(38.38),有花香、清香的反-橙花叔醇(22.51)和植物醇(15.91),具有清凉感的异佛尔酮(15.69)和(R)-二氢猕猴桃内酯(13.40);另有3种具有重要修饰作用的中性致香成分茄酮、β-大马酮、(E)-氧化芳樟醇。FZ1发酵雪茄烟叶后共有11种主要致香成分(ROAV>1),其中,有8种ROAV>10的关键赋香成分,包括表征干香特征的巨豆三烯酮A(80.44)和巨豆三烯酮B(64.87)、表征花果香的香叶基丙酮(47.78)和植物醇(18.37);茄酮(1.16)由修饰香气变为主要香气成分;此外新增2种修饰香气成分,分别为具有柠檬草香的6-甲基-5-庚烯-2-酮(0.64)和具有木香、花香的(S)-氧化芳樟醇(0.17),可被认为是FZ1发酵雪茄烟叶的特征致香物质;与刺激性呈显著正相关关系的苯乙醛和邻苯二甲酸二丁酯的ROAV降低。综上,FZ1发酵后巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、香叶基丙酮、茄酮和植物醇对香气贡献增大,可被认为在FZ1提高雪茄烟叶香气品质中发挥了重要作用。

3 讨论

雪茄中性致香成分含量是其香吃味形成的关键因素,研究雪茄烟叶中各组分及香气物质含量对判断烟叶品质有重要参考作用。利用微生物发酵可将烟叶中的大分子化合物转化生成醇类、醛类、酸类、酯类和酮类等香味成分,对于提升烟叶吸食品质具有重要价值和意义。芽孢杆菌属(Bacillus)是烟叶发酵过程中的优势菌属[22,25-26],瞿娇娇等[6]利用枯草芽孢杆菌发酵烟叶,其醇、酸和酯类含量分别增加28.15%、102.66%和22.29%,香气提高,刺激性减少。毛多斌等[22]用枯草芽孢杆菌发酵低等次烟叶,醛类、酮类、醇类和呋喃类香味成分含量分别增加6.5%、8.5%、8.2%和10.7%。研究将分离自进口雪茄烟支的地衣芽孢杆菌FZ1用于发酵雪茄烟叶,中性致香成分总量增加,其中,酮类、醇类、烯烃类、酚类等中性致香成分含量分别增加2.68%、4.11%、2.42%和0.26%;此外相比未接菌的雪茄烟叶新增加6-甲基-5-庚烯-2-酮、(S)-氧化芳樟醇和香叶基芳樟醇3种致香成分,分别为具有青草香、柑桔样的香气和有较弱的花香和木香,让FZ1发酵雪茄烟叶后香气更饱满、丰富。微生物发酵烟叶后香气的增加与其产生的纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和蛋白酶等对烟叶中大分子化合物的分解和转化有关,继而促进了致香成分的产生和积累[27-28]。李宁等[29]将蜡状芽孢杆菌添加到雪茄烟叶表面进行人工发酵后,蛋白酶活性增高,雪茄烟叶感官品质改善明显。李志豪等[30]将通过接种产木聚糖酶的蜡状芽孢杆菌可以降低烟叶纤维素,提升香气等感官品质。颜克亮等[31]从进口烟叶分离出的产解淀粉芽孢杆菌能产多种复合酶,所制成的生物制剂可使烟叶糖氮比、糖碱比更趋于协调,同时香气品质得到一定的提升。研究结果表明,经地衣芽孢杆菌FZ1发酵后类胡萝卜素、类西柏烷类和叶绿素等大分子化合物的降解产物含量均有较大提升,可能是菌体分泌出可降解这些大分子的酶类,与蒿洪欣等[32]的研究结果一致,发现芽孢杆菌可降解类胡萝卜素并产生明显香味。接种地衣芽孢杆菌FZ1发酵雪茄烟叶后香气品质明显改善,刺激性减少,但香气形成的具体机制还有待深入研究。

4 结论

通过人工接种分离自进口雪茄烟支中的地衣芽孢杆菌FZ1菌株发酵雪茄烟叶,烟叶香气更加丰富饱满,刺激性降低。香气总量明显提高,增加成分以烯烃类、酮类和醇类为主,包括香叶基丙酮、金合欢基丙酮、2,6,6-三甲基-2-环己烯-1,4-二酮、异佛尔酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮B、6-甲基-5-庚烯二酮、β-大马酮、茄酮和新植二烯等。其中,新植二烯、金合欢基丙酮、茄酮、香叶基丙酮、2,4-二叔丁基苯酚和植物醇是FZ1发酵雪茄烟叶的关键差异致香成分。