UPLC-MS/MS法同时测定奶粉中11种B族维生素含量*

余清，蔡林雪，苏晓明,3，吴少明，戴明*

（1.福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002；2.联勤保障部队第九〇〇医院仓山院区，福建 福州 350002；3.闽南科技学院 生命科学与化学学院，福建 泉州 362332）

0 引言

B 族维生素是一类水溶性小分子化合物，普遍以辅酶的身份参与大量分解代谢和合成代谢酶反应，其在人体内含量很少，却对人体内糖、脂肪和蛋白的代谢、确保机体细胞功能正常运行起到至关重要作用。每一种B族维生素的充足供应都是能量生产系统正常运作的必要条件，任何一种的不足都将限制产生能量的速度，从而可能造成严重的代谢和健康后果[1]，如VB12缺乏会影响婴儿体重、身高和头围，烟酸缺乏会导致包括先天性心脏病等在内的多器官出生缺陷[2]。B族维生素大多不能在机体内合成，必须通过食物或外界环境摄取和补充[3]。随着食物饮食结构的变化，人们从食物摄取的B族维生素日益减少，因此合成B族维生素常作为营养强化剂使用。目前，人体常用的B族维生素有11种，分别是维生素B1（硫铵素，Thiamine）、维生素B2（核黄素，Riboflavin）、维生素B3（烟酸，Niacin；烟酰胺，nicotinamide）、维生素B5（泛酸，Pantothenic acid）、维生素B 6（吡哆醛，pyridoxal；吡哆醇，pyridoxine；吡哆胺，pyridoxamine），维生素B7（生物素，Biotin）、维生素B9（叶酸，Folic acid）、维生素B12（钴胺素，cobalamins）[2,4]。

高效液相色谱法和微生物分析法是目前国家标准及相关文献[5-11]对B族维生素主要采用的检测方法，尽管利用高效液相色谱法进行前处理时简单便捷，然而测试过程中由于B族维生素的化学结构复杂，分离时需要使用离子对试剂使性质相近的目标物保留时间和洗脱顺序发生变化，这使该方法与多种维生素同时测定的实际需求有一定差距。此外微生物法则存在步骤繁琐、实验周期长、环境要求高、重复性较差等缺点。研究表明[12-15]，质谱检测器在测定维生素方面较于上述两种方法具有更明显的优势，可提供可靠、精确的相对分子质量及结构信息，具有分辨率高、灵敏度好、特异性好、重复性佳、定性定量更准确等特点。本研究以奶粉基质为对象，建立了超高效液相色谱-串联质谱测定奶粉中11种B族维生素的检测方法，该检测方法具有操作简便、用样量少、灵敏度高、重现性佳等特点，可有效满足食品安全抽检监测的要求。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂与材料

1290 Infinity 超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司）；高速冷冻离心机（Aanti J-E，美国Beckman Coulter公司）；超纯水纯化系统（Milli-Q，美国Mffljpore公司）；分析天平（BT224S，德国赛多利斯公司）；超声波振荡器（DS-8510 DTH，上海生析）；涡旋混均器（XHB，江苏康健）。

维生素B1（99%，LRAC2207）、吡哆胺二盐酸盐（99.5%，S2070100）标准品均购自美国Sigma；盐酸吡哆醛（≥99.0%，B1940050）、吡哆醇（≥99.0%，LRAB7025）标准品均购自上海安谱公司；维生素B2（98.27%，G983985）、烟酸（99.9%，G137932）、烟酰胺（99.39%，G976982）、泛酸钙（98.8%，N3670025）、生物素（99.0%，C10625000）、叶酸（99.5%，1-F-30C）、维生素B12（≥98.0%，MKCJ6408）标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer；甲酸、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；试验用超纯水由Milli-Q超纯水系统制备，电导率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

准确称取1 g市售奶粉样品于100 mL的容量瓶中，加入约80 mL的0.3%甲酸水溶解样品并摇匀，于25 ℃水浴超声30 min，加入2 mL的20%乙酸锌沉淀蛋白，冷却至室温后用0.3%甲酸水溶液定容至刻度并摇匀，经滤纸过滤后于15000 r/min、20 ℃下离心5 min，过0.22 μm滤膜，待进样。

1.2.2 标准溶液的配制

称取适量的11种B族维生素标准品分别置于25 mL容量瓶中，加水定容，配制成浓度约为1 mg/mL的混合标准品储备液，于4 ℃冰箱中冷存待用。准确吸取冷存的适量混合标准储备液分别置于5个25 mL容量瓶中，加水稀释定容至，并摇匀，得到浓度分别为10、20、50、100、200 ng/mL的11种B族维生素混标工作液。

1.2.3 仪器条件

⑴ 色谱条件

Waters UPLC HSS T3 柱（150 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱温：40 ℃；流动相：A相为0.3 %甲酸水溶液，B相为乙腈，流速0.3 mL/min。流动相梯度洗脱程序：0～1 min，1%B；1～4 min，1%B～30%B；4～5.5 min，30%B～95%B；5.5～6.5 min，95%B；6.50～6.51 min，95%B～1%B；6.51～8 min，1%B。进样量：2.0 μL。

⑵ 质谱条件

离子源及离子化模式：电喷雾电离源、正离子模式、ESI+；质谱扫描模式：多反应监测模式（MRM）；毛细管电压3.0 kV；干燥气温度160 ℃；干燥气流速16 L/min；雾化气压力30 psi；鞘气温度350 ℃；鞘气流速12L/min。11种B族维生素的质谱参数见表1。

表1 11种B族维生素的质谱参数

2 结果与分析

2.1 质谱和色谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

将1.2.2配制的混合标准储备液用50%乙腈-水溶液稀释，注入质谱进行采集分析，采用正离子模式扫描，根据各B族维生素化学结构、性质及质谱响应以确定11种B族维生素目标组分，及各组分相应的母离子、子离子，并优化碰撞能量CE、加速电压、Fragmentor电压等质谱参数。11种B族维生素的质谱参数详见表1。

2.1.2 色谱条件的优化

B 族维生素是一类水溶性小分子化合物，我国食品安全国家标准和国内、外文献[7-13]已证实C18柱、C8柱、HSS T3柱均可用于该类化合物的分离与检测，因此本试验分别比较BEH C18、BEH C8、HSS T3三种不同类型色谱柱的分离检测效果。结果表明，在流动相为0.1%甲酸水-乙腈体系下，采用HSS T3色谱柱时，各目标物的色谱分离度及峰形效果最好，响应值也最高，而BEH C18与BEH C8两种色谱柱对目标组分保留能力较差，详见图1。

图1 B族维生素在3种不同色谱柱分离条件下的多反应监测色谱图

2.2 前处理条件的优化

由于B族维生素目标组分采用正离子模式，流动相中可加入适量挥发性的甲酸使得目标组分离子化，从而提高目标物的离子化效率。本实验分别对0.1%甲酸水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈、0.3%甲酸水-乙腈组成的流动相体系进行研究，结果表明（详见图2），随着流动相中甲酸浓度的增大，各目标物的响应也随之增大，但甲酸浓度过高会影响色谱柱的寿命和样品稳定性。综上所述，本试验选择HSS T3色谱柱，0.3%甲酸水/乙腈作为流动相分离待测组分。

图2 B族维生素在3种不同流动相体系下的多反应监测色谱图

鉴于B族维生素易溶于水以及碱性条件下不稳定的特性，本文分别比较了水、50%甲醇水、50%乙腈水、0.1%甲酸水溶液作为提取溶剂时对各目标物的影响，每种溶剂平行实验3次，结果见表2。当采用0.1%甲酸水溶液提取时效率最高，11种目标物平均回收率介于75%～90%之间，而其余3种提取溶剂效果较差，尤其是VB1和吡哆胺的回收率均低于70%。

表2 B族维生素在不同提取溶剂下的平均回收率（n=3）

研究[14,15]发现适当提高提取液的酸度可以提高各物质的回收率。为筛选出最佳甲酸提取浓度，进一步对提取溶剂进行优化，本文进行进一步的试验，选择0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲酸水溶液四个浓度进行试验，结果如图3所示，11种目标物的初始回收率随着甲酸浓度的增大而增大，采用浓度0.3%甲酸水溶液时，各物质平均回收率在91%～101%之间，明显高于采用浓度为0.1%、0.2%甲酸水溶液时的回收率；而当甲酸水溶液浓度为0.4%，吡哆胺、叶酸、生物素回收率略高于0.3%甲酸水的提取效果，其余目标物的回收率与0.3%甲酸水溶液提取效果相当，综合考虑选择0.3%甲酸水溶液为本试验的提取溶剂。

图3 提取液中甲酸浓度对奶粉样品中B族维生素回收率的影响

2.3 标准曲线的绘制

按1.2.2方法配制11种B族维生素混标溶液并对其进行分析，重复测定3次，以标准溶液质量浓度为横坐标，目标组分定量离子的响应峰面积平均值为纵坐标，分别拟合标准曲线，计算得出11个B族维生素标准品的线性方程，详见表3。结果表明，在10～200 ng/mL浓度范围内11种B族维生素标准品线性相关性良好，相关系数（r2）均大于0.994。分别以3倍信噪比（S/N= 3) 对应浓度为方法检出限（LOD）和10倍信噪比（S/N= 3) 对应浓度为方法定量限（LOQ），最终计算得出方法检出限为5～20 μg/kg，方法定量限为16.7～66.7μg/kg。

表3 11个标准品的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4 加标回收率

本研究以市售奶粉样品作为研究对象，考察方法的回收率及其相对标准偏差（RSD）。在1.00、2.00、5.00 mg/kg 3个添加水平下（每个水平重复5次），按照1.2所述的方法进行检测。11种B族维生素的回收率在90.8%～103.8%之间，相对标准偏差RSD为1.6%～5.5%，详见表4。

表4 11种B族维生素的加标回收率及其相对标准偏差RSD(n=5)

2.5 实际样品检测

本试验对市场上销量较高的10种市售品牌奶粉，按照上述优化后的方法对11种B族维生素的含量进行测定，并与产品标签上的营养成分表明示值进行对比。奶粉样品中B族维生素含量为标签明示值的91%～103%，再次验证了本方法的可行性。

3 结语

本文采用超高压液相色谱-串联质谱法，实现了奶粉中11种水溶性维生素的同时、快速定量检测。样品经0.3%甲酸水提取、20%乙酸锌蛋白沉淀、Waters UPLC HSS T3 柱（150 mm×2.1 mm, 1.8μm）分离，电喷雾离子化，多反应监测（MRM）模式，外标法定量，在8 min完成11种B族维生素的测定。本方法具有操作简便、用样量少、分析时间短、灵敏度高、重现性佳等优势，适用于奶粉中B族维生素常规检测。通过测定10种市售品牌奶粉，测定结果为标签明示值的91%～103%，再次验证了该方法的可行性，因此该法可用于婴儿奶粉中11 种B族维生素的同时测定。