EGCG调控Nrf2对阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡的改善作用

左振岐,刘春辉

(1.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯154000;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯154000)

阿霉素(doxorubicin,Dox)做为临床常用的化疗药,严重的心脏毒性限制了其临床上的应用。目前普遍认DOX引起心肌细胞氧化应激和线粒体损伤等,还有一些研究发现细胞铁死亡与其有着紧密的联系[1-2]。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是从绿茶中分离出来得到的一种具有抗炎、抗氧化作用最有效的儿茶素类单体[3-4]。研究表明EGCG可有效缓解阿霉素诱导的心脏毒性[3],但其具体机制尚不清楚。本研究在体外建立阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型,观察细胞损伤模型中铁死亡的改变,探讨EGCG的保护作用途径与NRF2及铁死亡的相关性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

大鼠H9c2心肌细胞购自于中乔新舟生物科技公司。Dox、EGCG,ML385均购自于美国MCE公司;CCK8细胞活力检测试剂盒、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、血清铁(Fe2+)试剂盒均购自于南京建成生物有限公司;DMEM培养基、胎牛血清、胰酶细胞消化液、活性氧(ROS)、线粒体膜电位检测试剂盒均购自于碧云天公司;,一抗GPX4、NRF2、FPN1、HO-1,GAPDH、二抗山羊抗兔购自于abcam公司。

1.2 细胞培养及分组

大鼠H9c2心肌细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基,于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。1～2天进行传代一次,选取处于对数生长期的细胞分为4组:control组、DOX组(5 μmol·L-1DOX)、EGCG+DOX组(10 μmol·L-1的EGCG和5 μmol·L-1的DOX)、EGCG+DOX+ML385组(10 μmol·L-1的EGCG、5 μmol·L-1的DOX和2.5 μmol·L-1的ML385)。

1.3 DCFH-DA探针法检测ROS

选用对数生长期H9C2细胞,按control组、DOX组、DOX+EGCG组、DOX+EGCG+ML385组接种到12孔板中,去掉细胞培养基,PBS洗一遍,继续培养24 h。充分混匀去细胞培养液加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37℃培养箱孵育20 min,离心,用无血清培养基洗涤细胞3次,去除未进入细胞的DCFH-DA。用荧光显微镜镜检测及采图,选择红色荧光的强弱来表示细胞ROS的含量。

1.4 线粒体膜电位检测

取对数生长期的H9C2细胞按照1.3的分组接种到12孔板中,去掉细胞培养基,PBS洗一遍,继续培养24 h。按照试剂盒说明书配制JC-1染色工作液,吸除12孔板中原培养基,用PBS洗涤细胞一次,加入0.5 ml细胞培养液,再加入0.5 ml JC-1工作液,充分混匀。将细胞置于培养箱中37℃孵育20分钟。染色结束后,吸除上清,用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次。在荧光显微镜下进行观察,用红/绿光的平均光密度值来表示线粒体膜电位的高低。

1.5 MDA、SOD、GSH、Fe2+检测

H9C2细胞的培养、分组同1.3,取细胞的上清液,按照试剂盒说明书进行配制试剂。根据公式计算出MDA、SOD、GSH、Fe2+的含量。

1.6 Western blot检测

按照1.3进行细胞分组,加入RIPA总蛋白裂解液提取各组蛋白,使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。在蛋白样品中加入适当量的蛋白上样缓冲液,95～100℃沸水浴5 min。然后进行转膜,室温封闭1 h后,加入稀释好的GAPDH(1∶6 000)、GPX4(1∶2 000)、NRF2(1∶5 000)、FPN1(1∶2 000)、HO-1(1∶2 000)一抗4℃下孵育过夜,加入稀释好的二抗,室温孵育30 min,暗室显影,将胶片扫描存档,IPWIN60软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.7 统计学方法

采用SPSS25软件进行数据分析,数据用平均值±标准差表示。组间比较采用独立样本t检验,两组以上比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EGCG对阿霉素诱导的H9C2心肌细胞中ROS含量的影响

DOX组与control相比,可以显著增加细胞中ROS的含量(P<0.01)。加入EGCG后,与DOX组相比,EGCG+DOX组可以显著减低细胞中ROS的含量(P<0.01),表明EGCG可以有效降低细胞中的ROS。与EGCG+DOX组相比DOX+EGCG+ML385组中ROS的含量增加(P<0.01)。见图1。

**与control比较P<0.01;##与DOX组比较P<0.01;△△与DOX+EGCG组比较P<0.01

2.2 EGCG对阿霉素诱导的H9C2心肌细胞线粒体膜电位的影响

模型组中红/绿色荧光的平均光密度值 与control相比,显著减低(P<0.05)。与DOX组相比EGCG+DOX组中红/绿色荧光的平均光密度值显著增加(P<0.05)。与EGCG+DOX组相比DOX+EGCG+ML385组中红/绿色荧光的平均光密度值显著降低(P<0.05)。见图2。

**与control组比较P<0.05;##与DOX组比较P<0.05;△△与DOX+EGCG组比较P<0.05

2.3 EGCG对阿霉素诱导的H9C2心肌细胞MDA、SOD、GSH、Fe2+的影响

DOX组与control组相比,MDA、Fe2+的含量明显增加(P<0.01),SOD(P<0.01)、GSH(P<0.05)的含量明显降低。与DOX组相比,EGCG+DOX组中MDA、Fe2+的含量明显降低(P<0.01),SOD(P<0.01)、GSH(P<0.05)的含量明显增加。与EGCG+DOX组相比,EGCG+DOX+ML385组中MDA、Fe2+的含量明显增加,SOD、GSH的含量明显降低(P<0.05),差异就有统计学意义(P<0.05)。见图3。

*与control组比较P<0.05;#与DOX组比较P<0.01;**与control组比较P<0.01;##与DOX组比较P<0.05;△△与DOX+EGCG组比较P<0.05

2.4 EGCG对阿霉素诱导的H9C2心肌细胞GPX4、Nrf2、FPN1、HO-1蛋白表达的影响

DOX组与control组比,GPX4、Nrf2、FPN1、HO-1蛋白表达均发生显著的下降(P<0.01)。与DOX组比较,加入EGCG后GPX4、Nrf2、FPN1、HO-1蛋白表达明显上升(P<0.01)。与DOX+EGCG组比较,加入ML385后GPX4、Nrf2、FPN1、HO-1蛋白表达明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图4。

**与control组比较P<0.01;##与DOX组比较P<0.01;△△与DOX+EGCG组比较P<0.01

3 讨论

阿霉素在临床上是一种有效的蒽环类抗肿瘤药物,但其剂量依赖性心脏毒副作用一直是治疗中的焦点[5]。目前临床上治疗和预防蒽环类药物心脏毒性的药物大都有不同层面的不良反应和禁忌症,所以寻找一种安全有效的辅助药物来保护心脏是很有必要的。

EGCG是绿茶中最重要的活性成分,可发挥抗炎、抗氧化损伤的作用,并且对正常的组织和细胞无毒害作用[6-7]。张妍淞等[8]建立小鼠体内DOX损伤模型发现,EGCG对DOX诱导的小鼠心肌细胞的氧化损伤具有保护作用,同时对线粒体功能的保护作用显著。研究发现,EGCG可有效减少铁离子积累,抑制细胞内过量的ROS产生,从而减轻 Dox 心脏毒性诱导的铁死亡[9]。该实验加入EGCG干预后,可明显缓解阿霉素对心肌细胞的损伤。细胞中ROS、MDA、Fe2+水平明显降低,而GPX4、SOD、GSH水平显著升高。线粒体膜电位中可见JC-1红色荧光显著增加而绿色荧光显著减少,说明EGCG可以有效抑制阿霉素诱导心肌细胞发生铁死亡。

铁是机体中重要的成分,与机体的生理活动有着密切的联系,不同的生理环境和应激条件可能会导致铁死亡的发生[10-11]。铁死亡是不同于其他细胞死亡形式的一种新型的细胞死亡形式[12]。其主要机制是铁离子堆积过多导致脂质过氧化[13]。CAO等[14]发现GSH是铁死亡中的一个敏感指标,GSH的合成增加有助于抑制铁死亡[15]。GPX4在脂质过氧化中扮演着守卫者的角色,亦可看作是铁死亡的抑制剂[16]。铁死亡与很多疾病有着密切的关系,近年来发现DOX诱导的心脏毒性可能也与其有关[17]。LIU等[18]也证实了 DOX 相关性心肌病中铁离子及ROS的堆积过多诱导铁死亡的发生。本实验结果与其一致。说明阿霉素可以诱导心肌细胞铁死亡。

生理状态下,NRF2与Keap1在细胞质中相结合,然而,由于铁离子过多机体氧化应激水平提高导致了NRF2的核转位[19]。在铁死亡相关基因中,大多都与NRF2有着紧密的联系。在头颈癌细胞中Nrf2可通过调节GPX4的过表达来抑制铁死亡[20]。除此之外FPN1和HO-1的表达也受到NRF2的调控[21]。研究发现,在缺氧复氧细胞模型中,调节NRF2/HO-1信号通路可以抑制铁死亡[22]。但在阿霉素损伤模型中尚不可知。本研究中发现,在阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型中,NRF2蛋白表达减少,其下游因子GPX4、FPN1、HO-1的蛋白表达也随同一并下降。EGCG可以明显升高NRF2、PX4、FPN1、HO-1的蛋白表达。为了验证EGCG是否通过调控NRF2来改善心肌细胞铁死亡,加入NRF2抑制剂ML385进行干预,研究表明,ML385可明显削弱上述EGCG的作用,由此可发现EGCG是通过调控NRF2的表达发挥改善心肌细胞铁死亡的作用。

综上所述,EGCG可以有效的保护阿霉素诱导的心肌细胞铁死亡,其分子机制可能是通过调控NRF2的表达发挥保护心肌细胞铁死亡的作用。本研究从铁死亡的角度探讨了EGCG对阿霉素诱导的心肌细胞的保护作用,但仅进行了体外细胞的验证,尚有不足,后续会进行小鼠体内的实验进行进一步验证。