PSMD7在结直肠癌组织中的表达及意义

康云霞,何成彦,阿力木·罗合曼,何 平,孙景春

(吉林大学中日联谊医院 检验科,吉林 长春130033)

结直肠癌是人类第三大常见癌症,约占所有癌症的10%,也是癌症相关死亡的第二大原因。2020年全球约有190万新发病例和90万死亡病例[1]。近年来,随着经济发展以及生活方式和饮食的改变,中国结直肠癌的发病率和死亡率增加[2]。这给医疗系统带来了沉重的经济负担。因此,识别和评估新的生物标志物和治疗靶点迫在眉睫。目前,蛋白酶体26S非ATP酶调节亚基7(PSMD7)的表达及其在结直肠癌进展中的作用在很大程度上仍然未知。本实验通过分析PSMD7在结直肠癌组织中的表达,旨在为结直肠癌的诊断提供新的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本实验所用的标本为吉林大学中日联谊医院2018至2020年经外科手术切除的组织,共16对。所有患者在术前均未接受过任何治疗,且经病理确诊为腺癌。在术中分离癌组织,同时在距离癌组织上段5 cm处采集癌旁标本。将采集的标本立刻用预冷的PBS彻底冲洗后,于-80℃冰箱中储存。所有患者均签署了知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂

美国Agilent公司的液相色谱分析仪,美国ThermoFisher公司的TLQXL离子阱质谱仪,PSMD7抗体,β-actin多抗,蛋白定量试剂盒,DNA酶,RNA酶,PBS,裂解液,碘代乙酰胺,TPCK修饰的测序级胰酶,DTT,NH4HCO3,SDS,预制胶,苯甲基磺酰氟(PMSF)。

1.3 方法

1.3.1提取组织蛋白及测定浓度 在冰上配好裂解液,将癌组织与癌旁组织从-80℃冰箱中取出,加入液氮充分研磨后加入提前配好的裂解液,于冰上裂解30 min。去除掉样品中残留的DNA和RNA之后,低温条件下12 000 rpm离心10 min,吸取上清液即得到总蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,将蛋白样品加入96孔板,测得其在562 nm处的吸光度值,绘制蛋白标准曲线,计算蛋白浓度。

1.3.2二维质谱色谱联用技术 将蛋白样品制备成蛋白水解多肽混合物,将其溶解在0.1%的甲酸溶液中,用TLQXL离子阱质谱仪检测二维色谱分离的蛋白多肽后,得到质谱图。

1.3.3免疫印迹试验 使用10%的预混胶试剂盒制胶,先配10%的APS溶液(现配现用),按比例和顺序加入分离胶A、分离胶B、APS及TEMED,充分混匀后灌入玻璃板,用水压平,等待40～50 min。同样按比例配置浓缩胶,灌入浓缩胶后插入梳子,等待浓缩胶完全凝固。提前计算好蛋白样品的上样体积,电泳槽内加满电泳液,孔内加入Marker和蛋白样品,所有的孔都用loading buffer配平。10V电泳20 min,然后80 V电泳1.5 h。将快速转膜液按比例稀释,400 mA冰浴转膜24 min,快速封闭液封闭后,一抗孵育过夜。PBS-T洗膜3次,二抗4℃孵育1 h,PBS-T洗膜5次,最后ECL荧光化学法显色。

1.4 统计学方法

用SEQUEST算法分析二维色谱与质谱结果,利用SPSS20.0统计学软件分析所得数据,P<0.05差异蛋白具有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织与癌旁组织二维色谱质谱联用技术分析结果

本实验的癌组织与癌旁组织每个蛋白的丰度通过谱图数来衡量。衡量的标准如下:两个样品中蛋白谱图数的差值≥72;两个样品中蛋白谱图数的比值≥1。PSMD7作为其中一个上调蛋白,质谱图结果见图1。

图1 PSMD7质谱图结果

2.2 免疫印迹试验结果

分析16对组织中PSMD7的表达量,结果显示PSMD7在结直肠癌组织表达量明显高于癌旁组织,如图2所示。

图2 PSMD7 免疫印迹结果

3 讨论

结直肠癌是全球最常见的消化系统肿瘤之一,致死率较高。近年来,由于常规临床检查的普及、感染控制和手术技术的改善、成像技术的进步、以及化疗和放疗方面的进展,结直肠癌患者的5年生存率从50%上升到65%[3]。肿瘤的位置、年龄等因素是影响患者生存率的重要原因。局部结直肠癌患者的5年生存率可高达90%,区域转移患者生存率降至71%,而远处转移患者生存率低至14%[4]。因此,早期发现和诊断对于预防结直肠癌至关重要。

PSMD7蛋白是小鼠Mov34基因的人类同源物,定位于人类染色体16q23-q24区域[5]。PSMD7有几个明确的结构域,包括C末端特征性的KEKE基序,MPR1p 和 PAD1p N 端(MPN)结构域,转录调节因子结构域JAB[6]。MPN结构域是JAMM家族的一个显著特征。2004年,AMBROGGIO等[7]首次报道了原核生物黄球古菌AF2198(AfJAMM)的MPN结构域蛋白的晶体结构。根据MPN结构域蛋白是否具有异肽酶活性,可以进一步分为两个亚家族:MPN+家族和MPN-家族。PSMD7属于MPN-家族,其MPN结构域显示出典型的金属蛋白酶折叠,但它无法配位金属离子[8]。因此,PSMD7是催化失活的,似乎主要对26S蛋白酶体中的 Rpn11起支持作用[9]。PSMD7在多种类型的肿瘤进展中发挥作用。WANG等[10]的实验发现PSMD7在胃癌组织中高表达,且PSMD7的过表达促进了胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,并且其通过数据库预测了PSMD7与RAD23B之间的相互作用,并通过免疫共沉淀证实了RAD23B是PSMD7的一种新型底物。XU等[11]的研究表明,敲低PSMD7通过调节肿瘤细胞中的细胞周期蛋白和p53通路来减少增殖并诱导细胞周期停滞、衰老和凋亡,高PSMD7的表达预测肺腺癌患者的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)较差。还有研究通过对数据库的挖掘发现PSMD7表达与肿瘤亚型、肿瘤大小、淋巴结浸润和TNM分期密切相关。PSMD7敲低抑制关键细胞周期相关蛋白的表达,促进p21和p27在乳腺癌细胞中的稳定性[12]。此外,PSMD7下调有助于减缓肿瘤生长,抑制蛋白酶体功能,诱导细胞凋亡和mTOR/p70S6K通路在体内的活性减弱[13]。LC-MS将高分辨率LC与快速灵敏的MS检测方法相结合,可以检测数以万计的蛋白质,同时提供有关蛋白质丰度水平的相对定量信息。LC-MS已成为生物标志物发现和验证等转化研究的强大工具[14]。

本研究通过LC-MS和免疫印迹证实了PSMD7在结直肠癌组织中高表达,提示PSMD7可能是结直肠癌的新的生物标志物,为结直肠癌的临床诊断提供了新的依据。但PSMD7在结直肠癌进展中的分子机制还不清楚,需要进一步研究。