RNAi沉默原代星形胶质细胞IL-17基因表达方法的建立

沈笑然,朱瑞锋,郭佳翔,李凌舟,郭洪亮*

(1.首都医科大学附属北京安贞医院,北京100029;2.河南科技大学 临床医学系,河南 洛阳471000;3.首都医科大学附属北京朝阳医院,北京100020;4.马来亚大学,马来西亚 吉隆坡50603)

RNA干扰(RNAi)的发现开启了一场生物学革命,最终表明非编码RNAs在多细胞生物中是基因表达的中心调节因子[1]。这些小干扰RNA(siRNAs)很快成为生物学研究中普遍存在的工具,仅通过一个碱基序列就能轻松地抑制任何基因[2-3]。在研究领域中,RNAi不仅被用来调控基因表达、用于病毒性疾病治疗、研究基因功能,近年来RNAi技术也被当成一种研究细胞信号转导通路机制的新方法。本研究应用该技术沉默原代星形胶质细胞(Ast) IL-17表达,探讨IL-17的功能[4]。

1 材料与方法

1.1 材料

增强绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒(武汉,晶赛生物技术公司);Lipofectamine 2000(美国,Invitrogen);荧光显微镜(日本,OLYMPUS);C57BL/6小鼠(首都医科大学动物实验中心)。鼠抗IL-17单克隆抗体(武汉博士德生物制品公司)。

1.2 方法

1.2.1体外原代神经胶质细胞的制备 取新生C57BL-6小鼠乳鼠于-20℃冷冻,乙醇消毒,断头后取出脑,将分离出的皮层组织用眼科剪尽量剪碎成0.5 mm3的小块,移入无菌锥底离心管内,加入胰酶,消化,震荡,反复轻轻吹打组织,直至无明显组织块,形成细胞悬液;取细胞悬液过200目筛网后离心7 min,弃上清液,重悬细胞沉淀,计数板计数,之后倍比稀释到2.0×105·mL-1以传代备用。

1.2.2IL-17基因沉默质粒的构建及扩增 根据Gen Bank中登录的小鼠IL-17Am RNA序列(NM_010552.3),参照文献[5]设计确定3个RNAi 靶点序列为GGTCAACCTCAAAGTCTTTAA、GCAATGAAGACCCTGATAGAT、GCTGGACCACCACATGAATTC,并设计序列TTCTCCGAACGTGTCACGT 为阴性对照。按照Sense+Loop+Antisense+终止信号的方式设计对应的sh RNA序列,Oligo DNA 由武汉晶赛生物技术公司合成。按试剂盒操作说明书进行操作,中量提取超纯质粒。

1.3 细胞转染

分别用pGenesil-1A或B和Lipofectamine 2000转染原代神经胶质细胞Ast。步骤如下:每孔细胞被稀释成1.8 μg DNA,以及与稀释7.5 μl Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀,室温孵育形成DNA-Lipofectamine 2000复合物形成。逐滴加入500 μl 脂质体/DNA混合物到每孔中,摇动培养板使之混匀,孵育3 h。48 h后,荧光镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,并比较两段序列的转染效率。

1.4 沉默效果检测

选取转染效率高的质粒和对照质粒pGenesil-1C分别转染原代神经胶质细胞Ast,与脂质体/DNA混合物作用3 h后换成正常的高糖DMEM培养基后,与空白对照组比较,检测3组在3、6、12、24、48 h IL-17 mRNA表达。3、4、6 d后检测蛋白表达。

1.5 实验分组

实验组为 SiRNA-IL-17+Ast cell;阴性对照组(NC)(NegativecontrolSiRNA)+Ast cell;空白对照组为Ast cell(control)。

1.6 IL-17蛋白的Western blotting 检测

急性脊髓炎小鼠模型建立后,在疾病高峰期,麻醉处死大鼠,剪开脊椎骨,取脊髓组织,超声粉碎,离心取上清,以BCA法测定样品蛋白含量,上样,电泳分离,转印,杂交,结合一抗二抗,DAB显色,用凝胶图像分析系统扫描后,Bandscan分析条带灰度,分别计算靶蛋白条带的光密度与相对的β-actin条带光密度的比值,表示各组蛋白表达水平。

1.7 PCR法对IL-17mRNA的检测

根据Genbank检索的核苷酸序列用Premier 5.0软件设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。提取细胞总RNA,逆转录成 cDNA,加入M-MLV 逆转录酶,得到的产物以 GAPDH为内参照进行 PCR 扩增。经过预变性、变性、退火、延伸,30个循环。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳观察结果、照相,用凝胶图像分析系统扫描后,Bandscan分析条带灰度,分别计算 GDNF条带的光密度与相对的GAPDH条带光密度的比值,表示各组mRNA表达水平。

1.8 统计学分析

结果以mean±SD表示,应用SPSS13.0软件(SPSS,Chicago,IL,USA)进行统计学分析,组间差异比较采用单因素方差分析,两组之间的比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-17基因沉默质粒的鉴定

武汉晶赛生物技术公司构建的特异携带有IL-17 RNAi pGenesil-1质粒的彩色图谱及IL-17短发夹环质粒载体基因自动测序图。DNA测序鉴定结果显示干扰质粒pGenesil-1A、B均构建成功。

2.2 转染效率观察

转染后48 h在荧光显微镜下观察,因为转染后可使Ast细胞内有较强的EGFP表达,并在荧光显微镜下可被激发,说明转染获得成功。结果提示:pGenesil-1B表达的绿色荧光明显多于pGenesil-1A,分别为56.72%±3.19%、16.72%±1.93%(见图1)。

图1 带有EGFP标记的转染后的Ast细胞(A、B:400倍,转染48 h后携带绿色荧光蛋白表达的 pGenesil-1B,可见绿色荧光;C、D:400倍,转染48 h后携带绿色荧光蛋白表达的 pGenesil-1A,可见绿色荧光;其中A、C图为激发光下的图片,B、D为正常透光和激发光下的融合图片)

2.3 RT-PCR检测IL-17 mRNA表达量变化

IL-17基因沉默对照组IL-17表达量显著高于正常对照组,基因沉默组在3、6、12、24、48 h任一时间点IL-17 mRNA表达均低于正常对照组和基因沉默对照组(P<0.05),24 h IL-17比值最低(P<0.05)。见表1,图2、3。

表1 基因沉默后Ast IL-17 mRNA表达(n=36)

图2 Ast IL-17 mRNA结果

图3 不同时间点基因沉默后IL-17 mRNA表达

2.4 Western blotting 检测IL-17蛋白在3、5、7 d的表达情况

基因沉默模型组IL-17蛋白表达在沉默后3、5、7 d持续受抑制(P<0.05)。IL-17 RNAiB沉默效果优于IL-17 RNAiA,差异具有统计学意义(P<0.05。见表2、图4。

表2 基因沉默后Ast IL-17蛋白表达(n=36)

图4 IL-17-shRNA慢病毒转染后,于第3、5、7 d进行IL-17蛋白检测结果

3 讨论

在研究领域,为了解某一蛋白功能,方法之一就是在不表达该蛋白基因情况下,进一步来观察细胞或者动物的生物学功能特点,来揭示某种蛋白的作用及其机制,最具代表的技术就是RNAi技术和基因敲除技术,RNAi技术主要应用于细胞实验研究,而后者主要参与动物实验的研究[6-8]。与基因敲除技术相比,RNAi技术具有操作相对简单,效果明显,且技术难度低、费用低、实验周期短等特点。

本研究应用武汉晶赛生物技术公司构建的特异携带有IL-17质粒的图谱及IL-17短发夹环质粒载体基因自动测序图成功制备IL-17RNAi质粒,制备2条干扰质粒pGenesil-1A、B,均构建成功。因为转染后可使Ast胞内有较强的EGFP表达,所以应用Lipofectamine2000将质粒转染Ast后48 h在荧光显微镜下观察是否存在绿色荧光蛋白表达是转染成功与否的标志。该蛋白可在荧光显微镜下被激发绿色荧光,说明转染获得成功,结果提示:pGenesil-1B表达的绿色荧光明显多于pGenesil-1A,分别为56.72%±3.19%、16.72%±1.93%,说明构建的pGenesil-1B质粒效果更佳,进一步实验选取pGenesil-1B质粒作为实验的转染质粒。同时应用基因沉默技术后观察原代Ast细胞在IL-17基因沉默较对照组IL-17表达量显著减低,基因沉默组分别在3、6、12、24、48 h任一时间点IL-17 mRNA表达均低于正常对照组和基因沉默对照组。同时,基因沉默模型组IL-17蛋白表达在沉默后3、5、7 d明显减少(P<0.05)。另外,IL-17 RNAiB沉默效果优于IL-17 RNAiA,差异具有统计学意义(P<0.05),说明该技术可以成功抑制IL-17的细胞内表达。

在优化转染条件的过程中,原代的Ast细胞具有良好的生长状态是转染成功的关键因素之一。因此,在转染细胞的选择上,本实验选择原代健康具有活力的Ast细胞用于转染成功率更高。

总之,应用Lipofectamine2000可成功将IL-17 RNAi pGenesil-1转染至原代的Ast,转染效率较高,利用RNAi技术能有效抑制Ast中IL-17基因表达,为研究IL-17在神经系统疾病中的作用提供了有效的方法。