基于网络药理学预测金匮肾气丸治疗肝衰竭的作用机制

张炜崧,王 汉,孙 鹏,桑子淇,刘玉茹,叶 桐,刘铁军

(1.长春中医药大学 中医学院,吉林 长春 130117;2.中国中医科学院 中药研究所,北京 100700;3.长春中医药大学附属医院,吉林 长春 130021)

肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损害,导致合成、解毒、代谢和生物转化功能严重障碍或失代偿,出现以黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群[1]。肝衰竭病因其多样性,临床表现复杂,病死率极高,因此临床诊治难度大[2]。近10年来,国内关于重型肝炎、肝衰竭的中医证候规律、中西医结合治疗的研究日趋增多,中西医结合治疗能够提高患者的生存率,在改善症状等方面也有较好的疗效[3]。

肝衰竭属于中医“急黄”“瘟黄”等范畴,《诸病源候论·黄病诸侯》中记载:“脾胃有热,谷气郁蒸,因为热毒所加,故卒然发黄,心满气喘,命在顷刻,故云急黄也。”急黄(或瘟黄)在发病过程中可出现血证、鼓胀、肝厥等,病机上多属于“正虚邪实”,其基本病机集中在湿、热、毒、瘀、虚等几方面[3]。金匮肾气丸记载于张仲景的《金匮要略》,其方由熟地黄、附子、桂枝、山药、山茱萸、茯苓、牡丹皮、泽泻诸药组成,主要功效为温补肾阳、化气行水、滋阴化瘀。临床实践表明,金匮肾气丸不仅能减少腹水,还可降低黄疸、提升血中白蛋白浓度、改善凝血功能,广泛应用于治疗肝衰竭[4-10]。鉴于中药多成分、多靶点等原因,目前金匮肾气丸治疗肝衰竭的药效物质基础及作用机制尚未完全阐明。本研究从网络药理学出发,筛选金匮肾气丸的主要活性成分及作用靶点,挖掘临床患者肝衰竭已知的疾病靶点,根据网络拓扑分析及信号通路富集分析金匮肾气丸治疗肝衰竭的潜在作用机制,为金匮肾气丸治疗肝衰竭的进一步探索提供参考。

1 材料与方法

1.1 金匮肾气丸靶点预测和筛选

通过文献及TCMSP平台中筛选出8味中药的活性成分(满足OB≥30%且DL≥0.18)及相应的靶点。从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)检索文献中收集的化学成分,利用SEA数据库(http://sea.bkslab.org)、SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测其靶点。

1.2 肝衰竭相关基因的收集

基于GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)检索“liver failure”,对于Genecards数据库来源的数据筛选分数>14的结果,获得肝衰竭相关基因。

1.3 网络构建及核心靶点的筛选

在Venny 2.1.0软件中(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对金匮肾气丸活性成分的潜在靶点和肝衰竭相关基因取交集,且绘制韦恩图。利用Cytoscape_3.7.2软件(http://www.cytoscape.org/)进行“化合物-靶点-疾病”网络的构建,并将金匮肾气丸治疗肝衰竭的潜在靶点上传至STRING数据库中(https://www.string-db.org/),进行高置信度的靶点蛋白互作关系分析,在Cytoscape_3.7.2软件中构建PPI网络,根据介数中心性(Betweenness Centrality,BC),中心接近度(Closeness Centrality,CC),以及连接度值(Degree)的中位数来筛选核心靶点。

1.4 生物信息学分析

利用DAVID数据库对潜在治疗靶点进行GO分析和KEGG分析,设定物种为人,设置阈值:Pvalue<0.05。基于Cytoscape_3.7.2软件绘制“化合物-靶点-通路”网络[11]。

2 结果

2.1 金匮肾气丸活性成分收集及肝衰竭相关基因的获取

通过文献及TCMSP平台共得到金匮肾气丸82个活性成分,通过TCMSP平台、SWISS数据库、SEA数据库预测成分靶点,去除重复后共得到871个靶点。基于Genecards数据库、OMIM数据库筛选出肝衰竭相关的疾病靶点547个。

2.2 韦恩图的制作

利用Venny 2.1.0软件,将金匮肾气丸成分靶点与肝衰竭疾病靶点分别导入,分析得到76个中药-疾病共同靶点基因,即金匮肾气丸治疗肝衰竭的潜在靶点,绘制韦恩图,如图1所示。

图1 药物-疾病共同靶点韦恩图

2.3 “化合物-靶点-疾病”网络的构建

在Cytoscape_3.7.2软件中构建金匮肾气丸治疗肝衰竭的“化合物-靶点-疾病”网络,如图2所示,网络中共有159个节点和2 113条边,涉及82个活性成分和76个靶点,其中药物作用靶点用紫色节点表示,活性成分用绿色、蓝色及粉色节点表示。经文献检索进一步筛选出药理活性较好的18个核心成分见表1,分别来源于熟地黄的成分地黄苷A(Rehmannioside A,M1)、野菰酸(Aeginetic acid,M2)、海胆苷(Echinacoside,M3);来源于附子的成分乌头碱 (Aconitine,M4)、新乌头碱 (Mesaconitine,M5);来源于桂枝的成分表儿茶素 (Epicatechin,M7)、肉桂酸(Cinnamic acid,M8);以及来源于山药的山药素Ⅰ(Batatasin I,M17)、谷氨酸(Glutamic acid,M18)等。

表1 金匮肾气丸核心活性成分信息

图2 “化合物-靶点-疾病”网络图

2.4 金匮肾气丸治疗肝衰竭靶点PPI网络构建及核心靶点的筛选

构建金匮肾气丸治疗肝衰竭靶点PPI网络,如图3所示。根据BC≥0.004 856 45,CC≥0.553 030 3,以及Degree≥20筛选出30个核心靶点。其中节点的大小和颜色与Degree值正相关,Degree的大小决定了靶点在此网络关系重要性。表2展示了Degree≥21的IL-6(29)、VEGFA(29)、JUN(26)、MMP9(26)、EGFR(26)、MTOR(26)等20个核心靶点的信息。推测以上靶点可能在金匮肾气丸治疗肝衰竭中发挥重要作用。

表2 金匮肾气丸治疗肝衰竭的核心靶点拓扑分析信息

图3 高置信度PPI网络分析

2.5 生物信息学分析

利用DAVID数据库对金匮肾气丸治疗肝衰竭的潜在作用靶点进行GO和KEGG分析。其中有465个GO项目显著富集,360个在BP(生物过程)中富集,33个在CC(细胞组分)中富集,72个在MF(分子功能)中富集(图4)。包括氧化还原酶活性、T细胞受体信号通路、细胞生长的调节、丝氨酸型内肽酶活性、活化T细胞增殖、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、炎症反应、免疫反应等。

图4 交集靶点GO富集分析

KEGG通路显著富集138条,其中与炎症与免疫相关通路有HIF-1信号通路、JAK-STAT信号通路、TNF信号通路、B细胞受体信号通路、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路等;与细胞增殖和凋亡相关信号通路包括PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、Rap1信号通路、ErbB信号通路;与病毒感染相关信号通路包括乙型肝炎、丙型肝炎、冠状病毒病-新冠肺炎等;以及与其他机制相关信号通路包括癌症的途径、肝细胞癌、癌症中PD-L1表达和PD-1检查点途径、非酒精性脂肪肝等。基于文献和现有研究,筛选出其中10个关键通路,并绘制富集气泡图(图5)。以上结果表明金匮肾气丸可通过调节多个生物过程及多个通路的协调作用来治疗肝衰竭。“化合物-靶点-通路”网络(图6)共有100个节点和2 394条边,涉及30条KEGG通路和52个靶点,说明金匮肾气丸治疗肝衰竭的药理过程涉及多靶点、多途径。

图5 交集靶点KEGG富集分析

图6 金匮肾气丸治疗肝衰竭的“化合物-靶点-通路”网络

3 讨论

肝衰竭是临床常见的严重肝病症候群,病死率极高。在我国引起肝衰竭的主要病因是肝炎病毒(尤其是乙型肝炎病毒),其次是药物及肝毒性物质(如酒精、化学制剂等)[1]。虽然目前肝衰竭病死率随着抗病毒、人工肝、肝移植等方法的应用,有了一定程度的下降,但仍存在社会、经济、血源和肝源的困扰,人工肝及肝移植在我国尚难普及,肝衰竭的病死率仍高达50%～70%[12],探寻治疗肝衰竭的有效途径仍是当前医药领域广泛追求的目标。

祖国医学中并无肝衰竭病名,其证候多属本虚标实,实证中以毒、热、湿、瘀为主,虚证以阳虚、气虚、阴虚最为常见[13]。金匮肾气丸广泛应用于临床,其配伍特点有三:一是补阳之中配伍滋阴之品,阴中求阳,使阳有所化;二是少量补阳药与大量滋阴药为伍,旨在微微生火,少火生气;三是补中有泻,以补为主,以泻助补。故取其助阳亦化气、利湿亦化浊、滋阴亦清热之功,收阴阳共调、攻补兼施、标本同治之效。

目前金匮肾气丸已被证实的化学成分主要为生物碱类、三萜类、环烯醚萜苷类、单萜类、倍半萜类、氨基酸类、酚类、苯丙素类、黄酮类等[14-15]。现代药理研究进一步阐释了金匮肾气丸的药理作用,附子辛甘大热,为诸药之首,其含有M4、M5等化学成分,为C19-二萜生物碱中的双酯型生物碱的主要活性成分,具有抗肿瘤的药理作用[16];桂枝辛甘而温,为温通阳气之要药,与附子共为君药,周硕等[17]研究了桂枝中活性成分对体温的双向调节作用,桂枝煎剂及桂枝活性成分中的M8等均对小鼠的体温发热症状有效缓解;方中重用熟地滋阴补肾,取阴中求阳之效,与山茱萸、山药共为臣药,于震等[18]采用ip环磷酰胺造成小鼠白细胞减少,用M1进行治疗,以小鼠体质量、外周血象、网织红细胞数、骨髓有核细胞数和DNA量为观察指标,结果表明M1对骨髓造血功能和外周血细胞增殖具有促进作用,可增强免疫功能;山茱萸的活性成分M15可使NF-κB失活和Aβ25-35诱导的PC12细胞中MAPK磷酸化而减轻神经炎症反应[19];山药中含有丰富的氨基酸,其中含量最多的是M18,具有抗氧化、调节酸碱平衡、抗突变的作用[20-21];方中茯苓、泽泻、牡丹皮三药合用,寓泻于补,俱为佐药,研究表明茯苓的化学成分M12可抑制脂多糖诱导的肺泡上皮细胞氧化应激损伤和凋亡反应,其机制可能与激活Nrf2/Keap1/ARE信号通路有关,从而发挥抗氧化的作用[22];陆璐[23]通过实验证实M13可激活OGD/R诱导损伤bEnd.3细胞中的PI3K/AKT通路,表明M13可介导该通路发挥改善OGD/R损伤引起的炎症反应及细胞凋亡的作用;M9能有效调节肝星状细胞癌NF-κB作用,诱导肿瘤细胞凋亡,促进其抗肿瘤作用发挥[24]。诸药合用,助阳之弱以化水、滋阴之虚以生气,振奋阳气、气化复常,则诸症自除。综合以上现代药理作用的研究,金匮肾气丸具有抗肿瘤、抗炎与免疫调节、抗氧化、调节体温、抗突变等药理作用。

通过构建PPI网络,对金匮肾气丸治疗肝衰竭的靶点进行了网络拓扑学分析,结果显示FOS、PPARA、CTNNB1、MTOR、JUN、MMP9、MAPK8等靶点度值较高。经过生物信息学分析及筛选后发现,金匮肾气丸治疗肝衰竭的过程主要涉及10个关键通路,其中炎症与免疫相关通路有TNF信号通路、HIF-1信号通路、JAK-STAT信号通路;与细胞增殖和凋亡相关信号通路包括ErbB信号通路、PI3K-Akt信号通路;与病毒感染相关信号通路包括乙型肝炎、丙型肝炎;以及与其他机制相关信号通路包括癌症的途径、肝细胞癌、癌症中PD-L1表达和PD-1检查点途径。肝脏发生损伤时,肝细胞受到刺激信号,并迅速传导至细胞质内,IκB蛋白被降解,NF-κB大量转入细胞核,结合DNA上κB位点,启动其相关调控基因,发生转录,释放、上调相应表达产物(如炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6),随之局部炎症反应被激活、放大[25];在盲肠穿刺的小鼠脓毒血症模型中,通过抑制剂和基因敲减干预JAK2-STAT3通路,可有效阻断核转录因子NF-κB激活,提高小鼠的生存率,表明其具有抗炎调控的作用[26]。赵士龄等[27]经过体内外研究发现,氯胺酮处理胃癌细胞导致Bcl-2蛋白水平下降,同时Bax、caspase-3活性增强,进而诱导细胞凋亡,并能够使PI3K、AKT蛋白的磷酸化水平降低,有效抑制体内外肿瘤生长,且研究证明,PI3K/Akt/mTOR 通路能促进肿瘤细胞的生长、增殖和存活,同时对自噬产生负调控作用[28]。MUHLBAUER等[29]研究了肝组织内肝细胞、星状细胞和库普弗细胞表面抑制性受体PD-1的配体的表达水平,结果表明肝组织内这些细胞借助病毒感染,活化的T细胞以及1型干扰素能够上调细胞表面PD-L1的表达水平,因此,PD-1/PD-L1信号通路在调控肝组织内免疫活性细胞、病原体与免疫应答相互作用方面发挥关键作用。金匮肾气丸通过对多种癌症通路的调控说明了对可治疗不同类型的癌症疾病;参与凋亡通路可促使癌症细胞凋亡,抑制癌症细胞生长;且肝衰竭的主要病因是肝炎病毒感染,金匮肾气丸同时参与炎症与免疫相关通路以及肝炎病毒相关通路,因此在肝衰竭的治疗中有着重要的作用。

综上所述,金匮肾气丸主要作用于IL-6、VEGFA、JUN、MMP9、EGFR、MTOR等靶点,通过炎症与免疫、细胞增殖与凋亡、病毒感染、其他机制等多种途径来实现治疗肝衰竭的目的。本研究采用网络药理学方法,构建和分析PPI网络以及“化合物-靶点-疾病”网络,预测并阐述了金匮肾气丸治疗肝衰竭的潜在作用机制,为后续金匮肾气丸的临床与基础研究提供新的理论依据。