基于网络药理学和分子对接技术探讨理金安肺汤治疗肺小结节的作用机制

祝佳佳,许海柱

(1.上海市中西医结合医院,上海 200082;2.复旦大学附属华东医院,上海 200040)

肺小结节是临床常见病,也是严重困扰患者的慢性疾病。医学影像技术的快速发展使得许多肺结节患者在检查时被发现,而结节直径多在8mm以内,其中大多数结节仍处于良性阶段[1],无明显的手术指征。目前对于这类肺小结节患者,定期随访是主要的治疗策略[2]。然而中医药多成分、多靶点、协同作用等优势在控制肺小结节病灶、改善机体免疫力,缓解患者焦虑紧张情绪等方面都发挥重要作用,临床中亦有许多报道[3-4]。

本研究团队长期从事肺小结节的中医药防治工作,对肺小结节的病因病机特点等方面做了较多的研究[5-7],认为肺小结节的发生以气阴不足为始动因素,痰凝血瘀是结节的主要表现形式。并根据肺小结节的临床特点创立理金安肺汤,方中药物主要为黄芪、北沙参、石见穿、黄芩、天葵子、红豆杉、瓜蒌皮,地龙、桔梗等,以补肺养阴、化痰祛瘀、通络散结为主要功效,在临床取得较好的疗效。现代研究也发现方中的较多药物有提高机体免疫力、消炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[8-12]。但目前理金安肺汤的具体作用机制尚不明确。

本研究通过网络药理学方法,筛选理金安肺汤的主要主要成分,预测药物作用的关键靶点和相关通路,并利用分子对接技术验证主要成分和关键靶点的结合性能,初步阐释理金安肺汤治疗肺小结节的分子作用机制,为后续深入基础研究以及该方的现代化研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 有效成分的筛选及靶点预测

理金安肺汤主要由黄芪、北沙参、黄芩、石见穿、瓜蒌皮、海浮石、天葵子、地龙、桔梗、红豆杉组成。分别检索TCMSP数据库[13](https://tcmspw.com/index.php)、BATMAN-TCM数据库[14](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),选择口服生物利用度OB≥30%,类药性DL≥0.18作为纳入标准,以此得到北沙参、黄芪、黄芩、石见穿、天葵子、桔梗的全部活性成分及相关靶点。在SymMap数据库[15](http://www.symmap.org)、ETCM数据库[16](http://www.tcmip.cn/ETCM/)检索地龙、瓜蒌皮、海浮石的活性成分和相应靶点信息。通过查找文献找到海浮石、红豆杉中的主要化学成分,并利用PubChem数据库[17](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)核对成分结构进行化学名称的规范,并获取化合物的SMILES号。导入SwissTargetPrediction数据库[18](http://www.swisstargetprediction.ch/),选择预测值大于0的靶标作为靶点。经过整理去重,得到理金安肺汤活性化合物相关的靶蛋白信息,然后利用Uniprot数据库[19](https://www.uniprot.org/)将上述靶点进行标准化处理,以物种为人类作为筛选条件,获得理金安肺汤化合物的成分靶点。

1.2 肺小结节的靶点和交集靶点筛选

以“Pulmonary Nodule”为关键词从DrugBank[20](https://go.drugbank.com/)、GeneCards[21](https://www.genecards.org/)及OMIM[22](https://omim.org/)数据库中进行检索,删除重复靶点后获得肺小结节的疾病靶点。将理金安肺汤和肺小结节的靶点上传至Venny 2.1在线作图工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),绘制韦恩图,将得到两者的交集靶点作为理金安肺汤治疗肺小结节的潜在作用靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及关键靶点筛选

将获取的共同靶点导入STRING 11.0数据库[23](https://string-db.org/)进行蛋白互作分析(PPI),物种选择“人类”,选择隐藏游离靶点,设置最低互作分值为0.4,构建PPI网络。将获得的PPI数据导入Cytoscape 3.7.2软件中,以节点连接度(Degree)、紧密中心度(CC)和间距中心度(BC)作为参数标准选择关键靶点,并构建PPI网络图。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

利用Metascape数据库(https://metascape.Org/gp/index.html)对关键靶点进行GO富集和KEGG富集分析。GO富集分析包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)[24]三个方面。KEGG通路富集分析能够表明理金安肺汤治疗PN的潜在作用机制。本研究选择排名前15位的GO条目及排名前20的KEGG通路,以P<0.01为标准,利用微生信网站作图处理。

1.5 构建理金安肺汤治疗PN“活性成分-核心靶点-通路”网络图

利用GO和KEGG富集数据信息,通过 Cytoscape 3.7.2 软件(https://cytoscape.org/)绘制理金安肺汤治疗PN 的活性成分-核心靶点-通路图[25]。

1.6 分子对接

分子对接是2个或多个分子之间通过几何匹配和能量匹配而相互识别并构成稳定复合结构的过程[26]。将主要活性成分与PPI网络中Degree值最大的靶点进行分子对接,以对接分数值(Affinity)对主要活性成分与关键靶点之间的结合活性进行评价[27]。利用PubChem数据库下载主要化合物:槲皮素(Quercetin)、紫杉醇(Taxol)、花生四烯酸(Arachidonic acid)的SDF格式文件。从RCSB数据库(https://www.rcsb.org/)下载蛋白GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF的PDB格式结构。利用MOE2019[28]进行分子对接操作,Affinity<-4.25kcal·mol-1说明成分与靶点之间具有结合活性,Affinity<-5.0kcal·mol-1说明两者结合活性较佳,Affinity<-7.0kcal·mol-1说明两者对接活性强烈[29]。

2 结果

2.1 理金安肺汤活性成分及作用靶点信息收集

通过检索发现符合标准的理金安肺汤活性成分共102个,其中黄芪20个、北沙参8个、黄芩36个、石见穿2个、瓜蒌皮11个、海浮石1个、天葵子7个、地龙4个、桔梗7个、红豆杉6个。其中β-谷甾醇是北沙参、黄芩和石见穿共有成分,豆甾醇是北沙参和黄芩共有成分,槲皮素是北沙参、黄芪和石见穿共有成分,菠甾醇是瓜蒌皮和桔梗共有成分,金合欢素是黄芩和桔梗共有成分。利用SwissTargetPrediction数据库将活性成分的预测靶点进一步规范化并去重,最终得到作用靶点基因621个。药物-活性成分-作用靶点网络图见图1,其中节点的Degree值越大,节点形状越大。

注:图中圆形表示中药:北沙参(BSS)、地龙(DL)、瓜蒌皮(GLP)、海浮石(HFS)、黄芪(HQ)、黄芩(HQI)、桔梗(JGen)、石见穿(SJC)、天葵子(TKZ)、红豆杉(HDS);菱形表示作用靶点;六边形表示各中药的活性成分;A1～C3表示中药之间相同的活性成分。图1 药物-活性成分-作用靶点

2.2 疾病靶点的筛选和交集靶点筛选

通过检索发现DrugBank数据库中有疾病靶点73个,GeneCards数据库中有2 863个,OMIM数据库中有165个,去重后共得到疾病靶点3 048个。将数据导入Venny 2.1绘制韦恩图,得到理金安肺汤治疗肺小结节的潜在作用靶点共316个,见图2。

图2 中药与疾病交集靶点

2.3 PPI网络分析及关键靶点的筛选

将交集靶点导入STRING 11.0数据库,分析后得到PPI网络图。将PPI数据导入Cytoscape 3.7.2软件中,在网络中有315个节点和7 040条边。利用拓扑学分析方法,设置Degree≥45,CC≥0.504 8,BC≥0.000 3三个卡值条件,共筛选得到甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、血管内皮生长因子 A(VEGFA)、丝氨酸/苏氨酸激酶 1(AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、转录因子AP-1(JUN)、表皮生长因子(EGF)、丝裂原激活的蛋白激酶3(MAPK3)、半胱天冬酶3(CASP3)等关键靶点120个,提示这些靶点可能是理金安肺汤治疗肺小结节的关键作用靶点。靶点信息见表1。将关键靶点导入STRING11.0数据库得到PPI网络图,见图3。利用 Cytoscape 3.7.2软件绘制关键靶点PPI网络图,在网络中有120个节点和3 424条边,见图4。其中Degree越大,颜色越深、形状越大。120个关键靶点对应的核心化合物共有19种,其中槲皮素(Quercetin)、紫杉醇(Taxol)、花生四烯酸(Arachidonic acid)是Degree值最高的3个。

表1 核心靶点信息

图3 共同靶点PPI网络

图4 关键靶点PPI网络

2.4 GO富集分析

利用Metascape在线数据库对筛选到的120个关键靶点进行GO富集分析,前15个条目具体见图5。作用靶点的生物过程(BP)富集条目为对细胞因子的反应、细胞迁移的正调控、对激素的反应、对无机物的反应、蛋白质磷酸化的正调控、细胞对脂质的反应、酶联受体蛋白信号通路、造血或淋巴器官发育、对辐射的反应、细胞黏附的调节、细胞死亡的正调控、生殖结构发育、防御反应的监管、衰老、凋亡信号通路。作用靶点在细胞组成(CC)中的富集条目主要分布于膜筏、膜的侧面、受体复合体、转移酶复合物,转移含磷基团、转录调节复合物、细胞质核周区、囊腔、早期内体、黏着斑、磷脂酰肌醇3-激酶复合物,IA类、蛋白酶抑制剂复合物、内吞囊泡、核膜、蛋白质DNA复合物、内质网内腔。作用靶点在分子功能(MF)中的主要富集条目为激酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、细胞因子受体结合、蛋白质结构域特异性结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、激酶调节活性、磷酸酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、胰岛素受体底物结合、细胞因子受体活性、一氧化氮合酶调节活性、蛋白质同源二聚化活性、核心启动子序列特异性DNA结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合。

注:BP:生物过程;CC:细胞组分;MF:分子功能。图5 核心靶点的GO富集分析

2.5 KEGG通路富集分析

本研究对120个关键靶点进行KEGG通路富集分析,分析对前20条富集通路具体见表2,并绘制KEGG富集柱状气泡图,见图6。由图6可知,关键靶点主要富集于癌症通路、脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、膀胱癌、病毒致癌、JAK-STAT信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟、癌症中的转录失调、糖尿病心肌病、阿米巴病、NF-κB信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。基于KEGG富集分析结果,运用Cytoscape 3.7.2 软件建立“活性成分-靶点-通路”网络,并将主要活性成分、关键靶点和相应通路连接起来。包括159个节点(19个活性成分节点、120个核心靶点节点和 20个通路节点)和716个边,见图7。

图6 KEGG通路富集分析

注:倒三角表示通络;圆形表示作用靶点;菱形表示药物的活性成分。节点越大,表示Degree值越大。图7 理金安肺汤活性成分核心靶点通路

2.6 分子对接验证

选择PPI网络图中Degree值排名前7的核心靶点:GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF与理金安肺汤三种主要活性化合物槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸进行对接。在结合模式中,“A1-C3”显示活性化合物在相对应蛋白质上的整体结合位置;“a1-c3”显示化合物和蛋白质氨基酸残基之间氢键和疏水相互作用的二维平面图。活性化合物和关键靶点最低结合能热图见图8,在能热图中有组合21个,平均值为-5.868 3kcal·mol-1,其中对接得分最低的为TP53-槲皮素,分值为-4.938 6kcal·mol-1,对接得分最高的为TNF-紫杉醇,分值为-10.482 3kcal·mol-1,说明主要化合物与关键靶点之间均具有较强的结合活性。部分分子对接结果见图9。结果提示理金安肺汤对肺小结节有较好的治疗作用。

注:A:槲皮素;B:紫杉醇;C:花生四烯酸。图8 理金安肺汤中活性成分与核心靶点分子对接结合能热图

注:3D结构中蛋白质骨架以管形呈现,各配体呈棒状并用紫色着色。2D图中绿色为疏水性残基;紫色为极性残基。A1:槲皮素与AKT1;A2:槲皮素与EGF;B1:紫杉醇与GAPDH;B2:紫杉醇与VEGFA;B3:紫杉醇与TNF;C1:花生四烯酸与TNF;C2:花生四烯酸与TP53;C3:花生四烯酸与JUN。图9 分子对接构象

3 结论

网络药理学可以提供多靶点、多通路、多环节的新型模式,从系统生物网络层次分析解析治疗药物主要成分与疾病的相关性,能够为中医药作用机制研究和药物配伍规律等提供新的研究方法[30]。分子对接可以研究分子之间的相互作用,能够有效评估两者之间结合能力强弱[31-32]。本研究通过网络药理学和分子对接技术对理金安肺汤中主要成分进行分析,结果可以为肺小结节深入作用机制探讨提供参考依据。

3.1 理金安肺汤治疗肺小结节主要成分分析

理金安肺汤种中10味药共获得102个成分,通过PPI网络筛选最后取19个核心成分,其中槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸的度值最高,与疾病靶点联系密切。槲皮素主要来自于黄芪、北沙参、石见穿;紫杉醇来自红豆杉;花生四烯酸来自地龙,可以推测这三种化合物可能为理金安肺汤发挥治疗作用的主要成分。研究结果中发现槲皮素属于黄酮类化合物,具有很强的生物活性,能够起到抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等作用[33]。紫杉醇除具有较强的抗肿瘤作用以外,还具有抗氧化、调节免疫、抗炎、抗纤维化等多种作用[34]。花生四烯酸是一种长链不饱和脂肪酸,具有抑制血小板聚集、抗炎、抗肿瘤、抗脂质氧化等独特的生物活性[35]。肺小结节的发生多由慢性肺部炎症引起,之后有发展成为肺部恶性病变的可能性。通过主要化合物成分的分析,提示理金安肺汤可能通过抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤、调节免疫、抑制血小板聚集等作用来治疗肺小结节。

3.2 理金安肺汤治疗肺小结节关键靶点分析

本研究中共有316个主要成分与疾病的交集靶点,这些交集靶点中包括酶、受体、转录因子、信号分子等物质成分。从PPI网络中发现120个关键靶点,其中GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF等具有较高的度值,推测其可能为理金安肺汤治疗肺小结节的高相关性靶点。GAPDH是糖酵解过程中的一个酶,参与DNA修复、细胞凋亡、肿瘤发生等过程,几乎在所有组织中呈高水平恒定表达,在肺癌、肾癌、胃癌、肝癌等大部分肿瘤组织中表达上调。它通过促进磷酸甘油酸脱氢酶、细胞周期相关蛋白质表达和促进组蛋白甲基化,促进肿瘤细胞增殖,最终导致肿瘤的恶化[36]。AKT1是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的一个亚型,通过磷酸化作用激活或抑制其下游的靶蛋白,在炎性反应、细胞凋亡、肿瘤发生发展等发挥着重要作用[37]。研究也发现编码的VEGFA蛋白容易在缺氧状态下被表达,能够促进新生血管和癌细胞等的形成,使肿瘤出现生长、转移和存活等情况[38]。还有研究发现VEGF及其受体广泛分布于肺部,其表达水平与呼吸系统疾病病变密切相关,且在肺炎、肺癌以及肺纤维化等组织中高表达,也与疾病预后相关,具有较高的临床价值[39]。TNF主要由激活的巨噬细胞、免疫B细胞和T细胞等产生,在炎症环境中含量丰富,被视为促炎因子。能参与肿瘤细胞凋亡、机体免疫应答和炎症反应等,在关节炎、免疫系统疾病、肿瘤方面都有较好的治疗意义[40]。TP53是癌症中最常见的突变基因,能够促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,增强肿瘤细胞的代谢能力,在肺癌、胃癌、卵巢癌等多种癌症出现明显突变,尤其在小细胞肺腺癌方面突变率高达90%[41]。JUN是调节细胞增殖、分化和凋亡的关键转录因子[42],作为基因转录启动的分子开关,受到氧化应激、感染等刺激后促进TNF-α、IL-2、IL-8等多种炎症因子的表达,与肿瘤、哮喘、肺部炎症、自身免疫性疾病的发生发展有关[43]。EGF是一种保护性生长因子,其缺乏或过度表达都会破坏细胞增殖凋亡的平衡而产生疾病。研究发现长期炎症状态可使其受体EGFR过表达,容易导致多种肿瘤的发生,在肺癌中有40%～80%患者会出现,同时也和疾病进展、预后以及耐药性等有关[44]。关键靶点与疾病的炎症状态、免疫应答以及肿瘤侵袭等方面都有相关性,而且多数与肺部疾病直接相关,可以认为调控这些靶点功能是理金安肺汤发挥治疗肺小结节作用的关键。

3.3 理金安肺汤治疗肺小结节生物富集分析

本研究GO富集分析理金安肺汤治疗肺小结节的120个关键靶点主要涉及细胞增殖、细胞凋亡、基因表达、生物合成调控等生物学过程。这些过程与促进炎症修复、调节机体免疫、防止癌变等有关。KEGG通路富集分析发现理金安肺汤治疗肺小结节主要涉及炎症反应、免疫调节、细胞凋亡等多个复杂的生物学过程。途径主要为炎症和癌症相关通路,例如炎症相关通路包括IL-17信号通路、NF-κB信号通路、JAK-STAT信号通路、白细胞跨内皮迁移、细胞因子-细胞因子受体相互作用等;癌症相关通路有癌症通路、膀胱癌、病毒致癌、癌症中的转录失调、细胞程序性坏死、多物种凋亡等。其中IL-17是一种重要的促炎症细胞因子,可以诱导炎症因子和趋化因子的释放,刺激中性粒细胞增殖活化,参与肺炎、COPD、胰腺炎等多种炎症性疾病的发生发展[45-46]。NF-κB可通过促进TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-8等细胞因子的基因转录而介导肺部炎症和肺纤维化[47]。细胞程序性坏死是由基因控制的细胞自主的有序性死亡方式,在肺部疾病的发病过程中起重要作用,参与调控肺癌、肺部炎症等肺部疾病的发生发展[48]。这些信号通路提示理金安肺汤通过作用于潜在靶点,主要通过调节炎症、肿瘤、免疫等多种信号通路,调节肺部炎症因子的表达,控制炎症反应,抑制炎癌转变,从而控制肺小结节发展。

综上,本研究基于网络药理学初步探索了理金安肺汤的主要活性成分槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸等,可能通过GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF等靶点,作用于癌症、IL-17、NF-κB等信号通路治疗肺小结节。并利用分子对接技术,验证本方中主要活性成分能较好与关键靶点结合,为后续深入分子机制研究提供了基础。由于网络药理学仅通过对数据库中已知的中药有效成分进行归纳总结,未考虑中药配伍关系、中药剂型差异等诸多影响因素,故下一步仍需通过基础实验进行再验证,以便完善相关作用机制,推动中药复方研发和应用进程。