多参数系统辨识的开环温控系统及其在核酸检测中的应用*

史宝军，陈刘平，张子奇，魏春阳，李姗姗，2，李军委

（1.河北工业大学 机械工程学院 河北省机器人传感及人机融合重点实验室，天津 300130；2.电工装备可靠性与智能化国家重点实验室，天津 300132；3.河北工业大学廊坊分校 电子信息工程系，河北 廊坊 065000）

0 引 言

核酸体外扩增是分子生物学研究的基础，在体外以特定温度下进行的基于酶促的DNA扩增反应被广泛研究，许多装置被开发以满足扩增需求［1］。随着科技的快速发展，设备的微型化、集成化和智能化已然成为一种趋势［2，3］。微流体设备作为一种微反应器，表现出高效的传质传热效率、低样品消耗、高度集成化的优势［4，5］，可应用于食品检测、生化分析等多个方面［6～8］，是用来研究聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的有利工具。对于核酸扩增实验而言，温度的准确与否非常关键，如何准确测量和控制微流体实时温度是一个重要问题。

微流体反应体系采用的温控方式有闭环控制和开环控制，闭环控制精度较高，例如潘井宇等人［9］利用PID控制器设计了PCR 扩增荧光系统，实现了对传染病类的病原体（寨卡病毒）的检测；李志刚等人［10］提出Bang-Bang 算法结合PID算法的复合算法，完成了血液中病毒核酸快速检测。为实现微系统的集成化和小型化，有学者尝试使用开环控制方法实现微流控体系下的温度及控制和核酸扩增，例如Wu D等人［11］也通过开环控制去寻找PCR 的合适电压，实现连续流动的PCR循环；Liu C等人［12］设计了一种带有集成隔离膜的等温扩增器，利用热电偶校正输入电压和温度关系，使得后续实验不再重复估计电压和温度模型。本课题组前期研究中，以供电电压为参量，采用系统辨识［13］的方法对微流体实时温度进行了较为精准的控制，并在微流体芯片中成功合成了针状CsPbI3量子点。

考虑到环境温度对温控过程具有不可忽视的影响，本文提出一种基于多参数系统辨识的微反应系统开环控制方法，利用实验采集得到的多维温度数据，考虑供电功率、环境初始温度等参数对温控系统的影响，对微流体温控体系进行多参数系统辨识，得到温度控制模型，开发了相应的温度控制系统，该系统基于不同工况下温度传感器采集的实时温度数据，利用上位机温控模型的关键参数辨识，并根据下一轮数据采集来随时修正温控模型参数，充分降低了外部环境和硬件老化或漂移带来的干扰，保证了开环微流控系统温控的鲁棒性。最后，利用该系统完成了对鸭源性目的基因的恒温扩增，充分验证了此开环温控系统的温控性能的优异性能。

1 传热模型

1.1 系统模型传热分析

如图1（a）所示，基于多参数辨识的开环温控系统包括外部供电模块、基于STM32 的可调电压控制器、加热单元等，其中加热单元由铝制热沉、金属陶瓷发热体（metal ceramics heater，MCH）和微流体芯片组成。微流体芯片利用软光刻法制备，光刻膜使用SU—8 干膜，在聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）盖片表面得到微米级通道，然后与载玻片进行键合得到微流控芯片。系统通过可调电压控制模块准确控制输入电压，从而控制MCH加热片加热微流体芯片。

图1 微型开环温控系统示意和实物

取图1（a）所示的系统为研究对象，芯片内部微流体与玻璃基底之间的传热仅为几百毫秒，因此玻璃基底的温度可表征微流体的实时温度。为了获得系统的准确加热规律，通过可调电压模块改变MCH 加热片两端的电压值，如图2所示。可以看出，不同功率加热片温升特性都是相同的，本文取功率为10 W 的加热片进行研究，温升变化如图2（b）所示，可以看出，随着时间的改变，逐渐增大电压输入值，稳态温升值先快速上升，然后缓慢增加，直到达到稳态值，可见系统稳态温升值主要受外部施加电压的影响。

图2 不同参数下温控系统响应曲线

对图1（a）温控模块的热量传递进行简化分析，如图3所示，系统发热元件为MCH 加热片，其产生的热量由铝块传递到石英玻璃，中间会经过多次的热量传递及时间延迟，热量主要以温度传递的形式表现出来。

图3 微流体温控模块的热量传递模型示意

图3中，将MCH 氧化铝（Al2O3）陶瓷加热片本身的温升系数记为k1，时间常数记为τ1；铝块和石英玻璃在热量传递过程中的温升系数分别记为k2、k3，时间常数分别记为τ2、τ3；由经典控制理论可知，MCH加热片、铝块和石英玻璃热量传递过程分别符合一阶惯性环节［14］。又由于铝和石英传热速度远远大于PDMS，即τ1＜τ2≪τ3，则该温控系统可整体近似等于一阶惯性环节。考虑到系统为线性系统，故记该系统的总的稳态温升系数值为K；也考虑铝质导热片及石英玻璃的传热延迟，记系统总的响应时间为τ；MCH陶瓷加热片作为系统的发热元件，由图2可知系统的响应时间和稳态温升值均是关于输入电压和初始温度的函数，综合考虑整个开环温控系统的热量传递情况，系统的温升加热规律可以写成式（1）

式中 K为开环温控系统的稳态温升值，是关于输入电压U和室温T0的函数；τ为开环温控系统的响应时间，是关于输入电压U和室温T0的函数。

1.2 多参数辨识算例

如前所述，多参数系统辨识系统控制模型的求解，本质上是基于不同工况下温度传感器采集到的实时温度数据来完成，下一轮数据的采集会对前一轮得到的温控模型关键参数做出一定的修正，以避免外部环境和硬件老化或漂移带来的自身系统特性的干扰。因此，多参数系统辨识是一个动态求解过程，此处提供该算例阐述多参数系统辨识的求解过程。

由式（1）可知，微型开环系统模型参数有稳态温升值K和响应时间τ，K和τ均为关于输入电压U和室温T0的函数，利用图2（a）计算开环温控系统在3，4，5，6 V时的稳态温升值K和响应时间τ，如表1所示。

表1 当初始温度不同时，不同电压的温控系统稳态温升值及响应时间

为获取不同电压和初始温度下系统的稳态温升值及响应时间准确的模型，对不同电压和室温下系统的稳态温升值K及响应时间τ的数据进行处理，如图4所示。

图4 系统电压、室温分别与响应时间和稳态温升值的模型

则系统响应时间τ与电压U的模型关系如下

系统稳态温升值K与电压U的模型关系如下

式（2）和式（3）模型的线性拟合度均在99%，经过多次重复性验证，辨识参数的误差不超过1%，由式（1）可知，系统的温升模型如下

则开环微流控温度控制系统的实时目标温度模型为

式中 Td为目标温度，T0为实验环境的室温，td为达到目标温度所需的时间，U为MCH加热片两端施加的电压值。

特别地，当多参数系统辨识求解得到的关键参数的相对差值在1%之内时，停止进行对系统关键参数的下一轮修正。

2 温控系统开发

微型开环加热系统电路如图5 所示，采用负温度系数（negative temperature coefficient，NTC）热敏电阻（型号：10—D9）将温度变化转化为电阻变化，通过压分电路将电阻变化转化为数字数据，然后在单片机内实现模／数（analog to digital，A／D）转换。通过自行设计的半桥脉宽调制（pulse width modulation，PWM）电路，单片机驱动MCH加热片实现温度控制。同时单片机控制Pt100 温度传感器测量温度值，电风扇用于加热片散热。最后使用串口通信，上述电路可以通过上位机控制和监测。

图5 以STM32 为核心的开环温控系统电路

系统下位机设计采用编程语言为C语言的Keil开发环境。如图6所示，微流控温控系统的上位机可以通过参数辨识得到加热系统稳态温升值k 和响应时间τ 参数，更新温控系统目标温度Td模型，得到实时温度曲线。如图6（b），首先打开相应的串口接收实时数据，点击辨识规律，实现微流体温控系统的实时温度模型的更新。然后输入目标温度值Td和期待的反应时间td，点击开始，上位机得到实时温度响应曲线。设置采集数据方便保存数据。

图6 系统上位机流程和操作界面

3 实验验证与分析

多酶恒温核酸快速扩增（multienzyme isothermal rapid amplification，MIRA）技术是一种在恒温条件下高效完成的核酸扩增反应［15］，通过在恒温39 ℃下使基因片段扩增，检测结果能够可视化判别。为了验证该开环实时温度控制方法的可行性与有效性，采用MIRA 技术对鸭肉中提取的DNA模板进行扩增，利用显微镜观察检测结果处于荧光状态，证明温度控制的准确性。

反应试剂盒（安普未来生物科技有限公司，常州，中国）包括干粉管、缓冲液（Buffer）A和Buffer B、正对照引物探针混合物、正对照模板。实验时，在干粉管加入29.4 μL 的Buffer A、2.5 μL的Buffer B、4.6 μL的正对照引物探针混合物、11.5 μL的ddH2O和2 μL的正对照模板，充分混合，等待使用。

扩增实验在实验室内进行。实验室室温为27 ℃，设置期待的反应时间td为245 s。利用图1（b）搭建的系统将配置好的反应液分散成液滴［16］，并在显微镜下观察，拍摄暗场图片，如图7（a）所示；将芯片转移到恒温加热控制系统，加热20 min，在暗场下拍摄荧光图片，如图7（b）所示。可以看出，液滴发出强烈荧光，表明目的基因片段成功扩增，采用多参数辨识的方法成功将温度维持在39 ℃（±0.1 ℃），证明了该微流体温控系统采用多参数系统辨识的开环温度控制方法的可行性与有效性。

图7 利用MIRA技术，对鸭源DNA恒温扩增前后的对比

4 结 论

本文采用多参数系统辨识的方法获得了微流体系统准确的加热规律，基于模型的方法控制核酸扩增反应温度。建立了基于STM32的开环微流体温控的实时监测系统，研究了上位机随时辨识温控系统的主要参数，更新了系统加热模型，有效解决了开环温控系统不稳定性所带来的系统干扰，为核酸扩增反应提供了稳定而准确的温度。结果证明，该系统方法可靠，可重复性强，在核酸检测中有广阔的应用前景。