一株好氧反硝化菌的脱氮特性及其氮代谢机理研究

2023-10-24杨景瑞吕永康

工业水处理 2023年10期

杨景瑞，王莹，陈虎，吕永康

（1.山西能源学院资源与环境工程系，山西太原 030000；2.太原理工大学省部共建煤基能源清洁高效利用国家重点实验室，山西太原 030024；3.太原理工大学环境科学与工程学院，山西太原 030024）

氮是生物必不可少的元素，在水生生态系统的生化循环中至关重要。工业活动和大量氮肥的使用使氮循环在全球范围内加速，虽使人类受益，但也产生了一系列重大且具有挑战性的全球环境问题〔1〕。在水生生态系统中，工业废水排放的氮会污染淡水及其沉积物，对环境和人类健康有害〔2〕。沉积物中氮的富集会导致有害藻类大量繁殖，随全球变暖，此类事件急剧增加〔3〕。地下水硝酸盐污染和地表水富营养化是近几十年来频繁发生的问题〔4〕。因此，迫切需要开发新型的氮污染控制技术，尤其是脱氮技术，来保护水生生态系统。

生物反硝化被认为是减少自然或工程生态系统中氮污染，并在区域乃至全球范围内调节氮循环的最有效、低成本和环境友好的策略〔5〕。在传统理论中，由于生理、生物能量和动力学原因，细菌反硝化通常由厌氧反硝化细菌在溶解氧（DO）水平极低的水环境中进行〔6〕，传统生物反硝化过程脱氮周期长，容易受有机碳源和DO 等因素的影响。能在好氧条件下进行反硝化细菌的发现打破了传统反硝化的限制，强调了好氧反硝化的可能性。

在过去几十年中，研究人员已从废水〔7〕、活性污泥〔8〕、生物反应器〔9〕、垃圾填埋处理系统〔10〕、淡水水产养殖系统〔11〕、人工湿地〔12〕、城市景观湖泊沉积物〔13〕、河流〔14〕和海洋沉积物〔15〕中分离出好氧反硝化细菌。许多具有好氧反硝化能力的菌株已被鉴定和研究，包括Paracoccussp. YF1〔16〕、Pseudomonas mendocinaTJPU04〔17〕、Pseudomonassp. DM02〔11〕、Pseudomonas mendocinaS16、Enterobacter cloacaeDS’5〔18〕、Pseudomonas bauzanensisDN13-1〔19〕、Acinetobactersp. JR1〔20〕和Klebsiellasp. TN-10〔7〕等。好氧反硝化菌对氧气的耐受性比自养细菌更高，生长速度更快，可利用有机底物作为碳源（电子供体）和能源，将硝酸盐（电子受体）转化为含氮气体进行反硝化〔21〕，同时去除碳和氮。由于好氧反硝化菌在实际废水脱氮领域具有广阔的应用前景，迫切需要对其进行高效菌株的筛选和脱氮机理的详细研究。

本研究以从山西太原钢铁有限公司蒸氨废水中筛选获得的1 株高效好氧反硝化菌假单胞菌（Pseudomonassp. LV2）（简称LV2）为研究对象，对该菌株的脱氮性能及代谢机制进行了研究。具体目标：1）考察菌株的好氧反硝化性能；2）采用单因素设计法优化菌株好氧反硝化参数；3）根据好氧反硝化关键酶表达情况及元素守恒理论明确菌株的脱氮路径。研究结果可为深入了解好氧反硝化细菌的脱氮特性和代谢机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源与培养基

本研究所用菌株为1 株具有高效好氧反硝化功能的假单胞菌Pseudomonassp. LV2，筛选自太原钢铁有限公司蒸氨废水。

反硝化培养基（DM 培养基）组成：0.722 g/L KNO3、4.19 g/L 丙酮酸钠、0.75 g/L K2HPO4·12H2O、0.25 g/L NaH2PO4、0.01 g/L FeSO4·7H2O、0.01 g/L MnSO4·H2O、0.05 g/L MgSO4·7H2O、0.1 g/L NaCl，pH=7.0。

1.2 菌株的好氧反硝化性能评价

采用DM 培养基考察初始NO3--N 质量浓度为100 mg/L 时LV2 菌株的好氧反硝化性能。实验在装有100 mL 无菌培养基的250 mL 锥形烧瓶中以1%（V/V）的接种量一式三份进行，并将非接种样品作为对照组。将锥形烧瓶在30 ℃下以120 r/min 的摇床速度培养，定期从瓶中取样测定OD600，然后以10 000 r/min 离心10 min 获得上清液，测定NO2--N、NO3--N、TN 和COD。

1.3 影响菌株反硝化性能的单因素实验研究

通过单因素实验研究LV2 菌株在不同培养条件（碳源、培养温度、C/N、转速）下的好氧反硝化特性，进而对其好氧反硝化参数进行优化。碳源实验分别以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、丙酮酸钠、反丁烯二酸和葡萄糖作为DM 培养基的唯一碳源。C/N 实验分别将初始C/N 调整为4、8、12、16 和20，NO3--N 质量浓度固定为100 mg/L。为确定培养温度和DO 对NO3--N去除的影响，培养温度分别设置为15、20、30、40 ℃，摇床速度分别调整为0（DO≈2.30 mg/L）、40（DO≈2.93 mg/L）、80（DO≈3.25 mg/L）、120（DO≈4.72 mg/L）、160（DO≈5.64 mg/L）、200（DO≈6.24 mg/L） r/min。所有单因素实验均在含有100 mL 无菌培养基的250 mL锥形烧瓶中以1%（V/V）的接种量一式三份进行，并将未接种的样品作为对照实验。定期取瓶中样品测定OD600，然后以10 000 r/min 离心10 min 后取上清液测定NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN 和COD。

1.4 酶活性测定

LV2 菌株在30 ℃的DM 培养基中培养12 h 后，将菌液置于4 ℃、10 000 r/min 离心机中离心20 min获取沉淀物，然后将沉淀物重新悬浮于20 mmol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）中，之后利用超声处理使细胞裂解，在4 ℃、10 000 r/min 条件下离心20 min 后获得游离提取物。硝酸盐还原酶（NR）和亚硝酸盐还原酶（NIR）为微生物好氧反硝化过程中的两种关键酶〔22-23〕，其活性根据以往研究方法〔24〕测定。

1.5 气体检测与氮平衡实验

将1 mL LV2 菌株悬液孵育到含有100 mL DM培养基的250 mL 玻璃血清瓶中，将瓶子用高纯O2充分充气后在30 ℃、120 r/min 条件下密闭培养24 h，并以未接种系统作为对照实验。使用气密注射器在0 h 和24 h 检测来自瓶顶的气体样品（400 µL），通过配备热导检测器的气相色谱（GC）检测N2和O2，用烟气分析仪检测NO 与NO2。分别在0 h 和24 h 从瓶中取样进行氮平衡实验，以10 000 r/min 离心10 min 后得到上清液，用于测定样品中NH4+-N、NH2OH-N、NO2--N、NO3--N、TN、COD 和细胞内氮的含量。

1.6 分析与计算方法

使用分光光度计测量波长600 nm 处菌株的生长（OD600）。NH4+-N、NO2--N、NO3--N 和TN 根据国标法检测，NH4+-N 采用纳氏试剂分光光度法在420 nm 处测定，NO2--N 采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法在540 nm 处测定，NO3--N 采用酚二磺酸分光光度法在410 nm 处测定，用紫外分光光度法通过碱性过硫酸盐氧化检测TN 和细胞内氮。通过间接分光光度法分析羟胺浓度。利用溶解氧仪检测DO。COD 采用重铬酸钾法用COD 分析仪测定。

氮和COD 的降解率和去除速率分别用式（1）和式（2）计算。

式中：E——降解率，%；

R——去除速率，mg/（L·h）；

C0——COD 或氮的初始质量浓度，mg/L；

Ct——COD 或氮在t时刻的质量浓度，mg/L；

t——菌株孵育时间，h。

通过接种后非离心培养基的TN 减去培养基离心（8 000 r/min，10 min）后的TN，计算细胞内氮含量〔25〕。

2 结果与讨论

2.1 LV2 菌株的好氧反硝化特性

将1 mL 活化后的LV2 菌液接种至250 mL 含100 mL 灭菌的DM 培养基锥形瓶中，在转速为120 r/min（DO≈4.56 mg/L）和30 ℃的摇床中培养48 h，检测LV2 菌株的好氧反硝化特性，结果见图1。

图1 LV2 菌株在DM 培养基中的生长趋势与脱氮特性Fig. 1 The growth trend and denitrification characteristics of strain LV2 in DM medium

如图1 所示，LV2 菌株在孵育6 h 后直接进入指数生长期，OD600由6 h 时的0.169 增至24 h 时的1.09，表明LV2 菌株生长良好。初始质量浓度为99.4 mg/L 的NO3--N 在培育24 h 后迅速下降至8.73 mg/L，且在6～12 h 时NO3--N 的去除速率最大，达到7.75 mg（/L·h），24 h 后NO3--N 质量浓度基本保持不变。TN 和COD 的去除曲线与NO3--N 非常相似，NO3--N、TN 和COD 的最大去除率分别为98.5%、97.9%和93.5%，表明该工艺同时脱除了氮和有机碳，但培养24 h 后TN 略有增加，这可能是由于有机物不足导致死菌细胞释放少量氮。LV2 菌株的生长与其脱氮能力密切相关。在整个NO3--N 去除过程中未检测到NO2--N 的积累，这一结果与恶臭假单胞菌DS2 去除NO3--N 结果一致〔26〕，但与以海藻酸钠和羧甲基纤维素钠（SA-CMC）为载体固定反硝化菌的结果不同，后者在NO3--N 去除过程中检测到了NO2--N 积累〔27〕。以上结果表明LV2 菌株具有良好的好氧反硝化能力，具备在好氧条件下脱氮的潜质。

2.2 LV2 菌株的好氧反硝化性能优化

2.2.1 碳源影响

碳源是异养菌的能量和电子来源，是影响细菌好氧反硝化能力和细胞生长的重要因素。在温度30 ℃、转速120 r/min、C/N=16 的条件下研究了不同碳源对LV2 菌株脱氮性能的影响，结果见图2。

图2表明，NO3--N 去除率在被测碳源间存在显著差异。丙酮酸钠是最适合LV2 菌株好氧反硝化的碳源，24 h 内NO3--N 去除率为94.1%，同时OD600达到最大值1.12，这可能是因为丙酮酸钠参与了三羧酸循环，而三羧酸循环是微生物氧化的重要途径。当以丁二酸钠、柠檬酸钠和乙酸钠为唯一碳源时，LV2 菌株也表现出高效的好氧反硝化能力，24 h 内NO3--N 去除率分别达到91.5%、89.4%和82.4%。在测试的6 种碳源中，在以反丁烯二酸为唯一碳源时，菌株的生长量最小，反硝化性能最差；该结果与菌株Acinetobactersp. JR1 不同〔20〕，在以反丁烯二酸为唯一碳源时，菌株JR1 在培养24 h 后对TN 的去除率最高，反丁烯二酸是菌株JR1 的最佳碳源；这可能与菌株JR1 在酸性条件下具有优异的脱氮性能有关。对于LV2 菌株，在后续实验中选择丙酮酸钠作为最佳外加碳源。

2.2.2 温度影响

在DM 培养基中以丙酮酸钠为碳源，在C/N=16、转速120 r/min 条件下，不同温度（15～40 ℃）对LV2菌株生长及NO3--N 去除特性的影响见图3。

图3 48 h 内不同温度对LV2 菌株反硝化性能的影响Fig. 3 Effect of different temperature on the denitrification performance of strain LV2 within 48 h

图3（a）显示LV2 菌株能够在15～40 ℃生长。OD600和NO3--N 质量浓度在40 ℃时变化很小〔图3（a）和图3（b）〕，在15～30 ℃内48 h 时NO3--N 的去除率均在85.0%以上〔图3（d）〕，且在30 ℃时达到了97.2%的最佳去除率。NO3--N 和COD 去除率变化趋势与细胞生长趋势一致，随温度升高，NO3--N 和COD 的去除速率先加快后减缓〔图3（b）和图3（c）〕，较低温度下细菌生长需要更长的滞后期，温度升高至30°C时OD600最大，达到1.11（24 h），因此LV2 菌株的最佳培养温度为30 ℃。这可能是由于20～33 ℃条件下好氧反硝化的酶活性增加〔28〕，这与之前的报道称适宜好氧反硝化细菌生存的温度为中温条件（30～37 ℃）结果一致〔25，29〕。然而，在30 ℃下24 h 后观察到NO3--N 去除率增加的同时伴随OD600从1.11 降至0.93，这可能是由衰变阶段的细胞裂解引起的。

2.2.3 C/N 影响

为确定不同C/N 对LV2 菌株在DM 培养基中去除NO3--N 效果的影响，在以丙酮酸钠为单一碳源、培育温度为30 ℃、培养时间为24 h、转速为120 r/min 的条件下设计了一组实验，结果见图4。

如图4 所示，当C/N 从4 增加到12 时，24 h 内OD600、NO3--N 和TN 的去除率分别从0.323、37.3%和36.4%增加到0.788、82.5%和74.3%；当C/N 为4～12时，LV2 菌株对COD 的去除率均达到97.0%以上。低C/N 下NO3--N 和TN 的残留主要是由碳源供应不足造成的，这将损害微生物的生长和反硝化所需的电子供体〔30-31〕。当C/N 增加到16 和20 时，LV2 菌株对NO3--N 和TN 的去除率没有太大差别，分别达到98%和92%左右，且在C/N=16 时OD600达到最大值1.11。然而，OD600和COD 去除率在C/N=20 时都有所下降，这一结果表明氮源的耗尽可能导致COD 的低降解，因为碳源的供应高于其需求。考虑到NO3--N、TN 和COD 的去除效果以及菌株生长密度，C/N=16更有利于实现成本效益高的好氧反硝化作用。

2.2.4 转速影响

DO 是脱氮过程中的主要控制参数〔32-33〕。在以丙酮酸钠为碳源、温度为30 ℃、C/N=16 的条件下，通过调节振荡转速来控制培养基中的DO，研究了DO对NO3--N 去除效果的影响，结果见图5。

图5 24 h 内不同转速对LV2 菌株反硝化性能的影响Fig. 5 Effect of different rotational speed on the denitrificationperformance of strain LV2 within 24 h

如图5 所示，NO3--N 去除率从0 r/min 时的50.5% 显著增加到120 r/min 时的98.4%，对应的OD600由0.46 上升为1.11；当振荡转速超过120 r/min时，NO3--N 去除率无明显差异，OD600下降。不同转速下TN 去除率趋势与NO3--N 一致。适当增加振荡转速可显著促进细胞生长和NO3--N 的去除，这可能是由氧传质系数随转速增加而增大导致。此外，适当提高转速可以提高细菌与NO3--N 的接触强度和混合程度，从而促进LV2 菌株的生长，提高对NO3--N 的降解效率。此外，还发现当振荡转速超过120 r/min时，OD600逐渐降低，这可能是由于剧烈振荡对细菌生长产生了一定的负面影响。因此，振荡转速固定在120 r/min。

2.3 LV2 菌株的好氧反硝化去除路径

为研究LV2 菌株参与脱氮过程的好氧反硝化途径，在好氧条件下评估了两种关键酶NR 和NIR 的活性。24 h 内LV2 菌株反硝化过程中NR 和NIR 活性及N2产生情况见图6。

图6 24 h 内LV2 菌株反硝化过程中NR 和NIR 活性（a）及N2产生情况（b）Fig. 6 NR and NIR activities（a） and N2 production（b） during the denitrification process of strain LV2 within 24 h

图6（a）表明，在无细胞游离提取物中检测到了NR 和NIR 这两种酶，酶活性分别为0.057 µmol/min和0.052 µmol/min。NR 和NIR 是反硝化过程的关键酶，分别负责硝酸盐向亚硝酸盐和亚硝酸盐向氮气的好氧转化，NR 和NIR 的存在进一步证明了LV2 菌株的好氧反硝化能力。

为进一步证实LV2 菌株的脱氮机理，在好氧反硝化过程中进行了气体检测。通过气相色谱对充满O2且以NO3--N 为唯一氮源的密闭系统中的气体进行了定性分析，结果见图6（b）。实验组中检测到了N2，且用烟气分析仪对收集的气体进行检测，没有发现NO 和NO2气体。N2的产生进一步证实了LV2 菌株在好氧条件下发生了异化脱氮。

对密闭系统内水样进行氮平衡分析，结果见表1。

表1 LV2 菌株反硝化过程的氮平衡Table 1 Nitrogen balance in denitrification process of strain LV2

对起始点0 h和培育24 h水样的分析（表1）表明，NO3--N 浓度显著降低，去除率达到98.6%，NO2--N、NH4+-N 和NH2OH 积累很少，通过同化作用生成的细胞内氮和通过反硝化作用生成的气态产物N2分别占初始NO3--N 的69.7%和23.4%。损失的5.12%的氮源可能是由采用不同分析方法产生的测量误差造成的。结果表明，LV2 菌株主要通过两种不同的代谢途径去除NO3--N，一种是NO3--N 通过同化作用被用于细胞合成，另一种是通过好氧反硝化作用转化为N2。