西瑞香素通过介导巨噬细胞向M2极化对鼻咽癌大鼠线粒体通路的影响

王虹园 王继国 任庆

(天津市第五中心医院耳鼻咽喉科,天津 300450)

鼻咽癌是发生于鼻咽腔顶部和侧壁的耳鼻喉科常见恶性肿瘤,其发病率位居耳鼻咽喉恶性肿瘤之首,5年生存率仅为30%,且极易复发,对患者的身体健康及生命安全造成了极大威胁〔1〕。临床上因鼻咽癌对放疗敏感性较高,故对于鼻咽癌患者的治疗首选方法为放射治疗,同时根据患者的癌症分期及耐受性给予化学治疗及手术治疗〔2〕。虽然这些治疗手段在临床上取得了明显的治疗效果,但其毒副作用严重,且很容易产生不同程度的后遗症,因此探寻新型有效且安全性高的治疗药物就显得尤为必要。鼻咽癌的病因目前尚未完全阐明,但有研究表明,炎症及免疫系统紊乱是绝大多数癌症的发病根源,鼻咽癌也是如此,而巨噬细胞极化在其中发挥着不可忽视的作用〔3〕。巨噬细胞因其位置和微环境不同可极化为M1型和M2型,M1型巨噬细胞具有抗肿瘤免疫功能,而M2型巨噬细胞则可介导免疫抑制的形成,从而促进癌细胞的生长及转移〔4〕。有研究发现,细胞凋亡程序的紊乱与肿瘤等多种疾病的发生密切相关,细胞凋亡对于维持组织稳态和预防癌症发展至关重要〔5〕。而介导细胞凋亡主要有3条通路,即线粒体通路、死亡受体通路及内质网通路,其中线粒体作为细胞凋亡的调控中心,在调控细胞凋亡信号转导中具有起始、整合与信号放大的作用,因此线粒体通路是本文研究的重点〔6〕。西瑞香素是以醚键结合的双香豆素类衍生物,是天然药物的一种,具有低毒、来源广、生物活性多样的特点,同时其在抗炎、抗病毒、抗肿瘤等方面发挥着重要作用〔7〕。但其对于鼻咽癌的研究相对较少,因此本文就西瑞香素通过介导巨噬细胞向M2极化对鼻咽癌大鼠线粒体通路的影响进行研究探讨,为临床治疗鼻咽癌提供理论基础。

1 材料与方法

1.1动物 选取北京维通利华实验动物技术有限公司提供的40只SPF级SD雄性大鼠〔合格证书:SCXK(京)2019-0051〕,平均体质量200～250 g,大鼠单笼喂养,室温生长,模仿12 h昼夜交替,在常温下进行无菌自由进食、饮水2 w,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2仪器与试剂 盐酸千金藤碱(A141282,上海邦景实业有限公司);西瑞香素(D1453-20 mg,上海宝曼生物科技有限公司);二亚硝基哌嗪(SCSI-316048,上海赛可锐生物科技有限公司);佛波醇酯(YC-1509,安徽永纯生物技术有限公司);TUNEL检测试剂盒、生理盐水(YT2205、YT3740,北京伊塔生物科技有限公司);重组末端核苷酸转移酶(rTdT,10533065,北京泰泽嘉业科技发展有限公司);碘化丙啶(PI)染液(JKMK1509A,上海经科化学科技有限公司);实时Real-Time聚合酶链反应(PCR)仪(7500,美国 Invitrogen公司);实时Real-Time PCR 试剂盒(7000,美国ABI公司);Trizol试剂(NR0002,雷根生物科技有限公司);cDNA 第一链合成试剂盒(KR104,北京天根生化科技有限公司);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、电化学发光(ECL)检测试剂盒、全蛋白抽提试剂盒(KGP113、KGP1123、KGP250,江苏凯基生物科技发展有限公司);高速冷冻离心机(5024R,德国Eppendorf公司);光学显微镜(CX-60,日本OLYMPUS公司);自动包埋机(EG1150,德国Leica公司);苏木素染液(H9627,美国Sigma公司);伊红染液(AG1100-100 ml,上海吉至生化科技有限公司);percoll分离液(P7828-100 ml,上海联硕宝为生物科技有限公司);CD68抗体、CD163抗体(11192-MM06、100473-T36,北京义翘神州科技股份有限公司);柠檬酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH6.0,ZKP0789,深圳子科生物科技有限公司);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(60004-1-Ig,美国Proteintech公司);多聚甲醛(158127,Sigma-Aldrich-LLC.公司)。

1.3分组与模型制备 选取40只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常(N)组,模型(M)组,盐酸千金藤碱(C)组,西瑞香素(W)组,每组10只。各组在建模前10 h禁食、禁水,然后对M、C、W组给予腋部皮下注射诱癌剂二亚硝基哌嗪15 mg/kg及促癌剂佛波醇酯100 mg/kg,3 d注射1次,连续注射28次,当大鼠打喷嚏超10次、并出现抓鼻不止、流涕满面等现象时则视为建模成功,N组不建立该模型,同期给予同体积生理盐水。建模成功后,对C组灌胃15 mg/kg盐酸千金藤碱,对W组灌胃24 mg/kg西瑞香素,两组均1次/d,持续21 d,N组、M组同期给予灌胃同体积生理盐水。

1.4标本采集 各组实验结束后安乐死,并迅速游离出上颌骨,于冰上取出鼻咽组织,多久甲醛固定96 h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后放入冰箱中密封保存。

1.5鼻咽组织病理检测 取部分鼻咽组织,用梯度乙醇及二甲苯进行脱水后,进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡及复水,然后用苏木素-伊红(HE)染液进行染色,除去多余染液后,梯度乙醇及二甲苯脱水、透明后,进行中性树胶封片处理,用光学显微镜进行组织病理学观察。

1.6鼻咽组织细胞凋亡检测 采用末端脱氧核苷酸标记法(TUNEL),取部分鼻咽组织石蜡包埋、切片、脱蜡及水化后与蛋白酶K进行室温孵育10 min,多聚甲醛及PBS分别浸泡5 min,除去多余液体后,将切片浸入联合抗生物蛋白过氧化氢酶和二氨基联苯胺的平衡液中,室温下放置10 min,取出PBS冲洗3次,加入rTdT,在37 ℃、避光的条件下孵育60 min,将切片浸入盐类-柠檬酸盐缓冲液(SSC)溶液中,温室放置15 min后PBS洗涤2次,用PI进行染色,在荧光显微镜下观察,(520±20)nm处观察绿色荧光,>620 nm处观察红色PI,细胞核中绿色荧光为凋亡细胞,随机选择5个视野下的细胞观察凋亡率。凋亡率=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.7线粒体通路相关指标检测 RT-PCR法检测线粒体通路中B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X基因(Bax)及细胞色素(Cyto)-C mRNA表达,取各组鼻咽组织制成匀浆后,加入Trizol试剂以提取总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度,提取完成后用电泳仪检测其完整性,用cDNA 第一链合成试剂盒进行逆转录合成 cDNA,然后在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,在94 ℃条件下,预变性10 min,变性30 s,70 ℃延伸1 min,59 ℃退火30 s,以此循环40次,荧光实时定量PCR仪收集Bcl-2、Bax及Cyto-C荧光信号,反应结束后进行数据分析,以同一样本中的GAPDH的Ct值作为内参,采用 2-ΔΔCt计算其基因相对表达量,引物序列:Bcl-2上游ACAGGTGTAAGCCACCGAAC,下游GTTGCAGTGAGCCAAGATCA;Bax上游TGGTGAAACCTTGTCTGCAC,下游CTTTGCCTTCTGGGTTCAAG;Cyto-C上游GGAGAGGATACCCTGATGGA,下游GTCTGCCCTTTCTCCCTTCT;GAPDH上游GTAAGAAACCCTGGACCACC,下游CTGGGATGGAATTGTGAGGG。

1.8鼻咽组织中巨噬细胞极化特异性标志物检测 Western印迹法检测大鼠鼻咽组织中M1型特异性标志物CD68及M2型特异性标志物CD163蛋白表达:取各组鼻咽组织,剪碎后加入1 ml RIPA裂解液,在冰上充分搅拌10 min,在4 ℃、12 000 r/min的条件下离心20 min,取上清液,用二喹啉甲酸(BCA)法测定,将各组蛋白调至等浓度后进行电泳,电泳完成后,用半干法将凝胶上蛋白转移至甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,转膜1.5 h、封闭2 h,加入稀释的CD68、CD163一抗(1∶1 000),4 ℃摇床振荡孵育过夜后洗膜;加入稀释的二抗(1∶5 000),37 ℃轻摇室温孵育 2 h;洗膜后,用电化学发光(ECL)荧光试剂盒测定结果,计算与GAPDH比值求得CD68、CD163蛋白的相对表达。

1.9巨噬细胞检测 取M组鼻咽组织剪碎置于离心管中,加入Ⅳ型胶原酶使其终浓度为1 mg/ml,在37 ℃、300 r/min条件下,摇床上摇晃1 h,过滤离心,弃掉上清液后重悬,再次离心,弃掉上清液重悬,在4 ℃下沉淀离心3次,取3次上清液,将3次上清液混合后,在4 ℃下离心5 min,弃掉上清液重悬,将其小心铺到25%～50%的percoll上方,每部分体积为4 ml,然后在室温、2 000 r/min、降速调为1的条件下进行梯度离心20 min,离心后在25%与50%界限处的为巨噬细胞。体外巨噬细胞极化实验:将得到的巨噬细胞进行体外常规培养,取培养后的巨噬细胞,将其分为两组,加入PBS记为A组,加入西瑞香素记为B组,两组共培养后,用Western印迹法检测CD68及CD163蛋白表达。

1.10统计学分析 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析,事后检验采用SNK法,组间两两比较采用t检验。

2 结 果

2.1各组HE染色 N组鼻咽组织细胞层次清晰且大小均匀,排列整齐;M组细胞层次变多,细胞形态及排列均不整齐,可见多细胞核且染色明显变深,出现大量鳞状上皮增生及炎性细胞浸润,而C、W两组症状明显改善,且W组比C组改善明显。见图1。

图1 各组鼻咽组织结构(HE染色,×200)

2.2各组细胞凋亡 与N组〔(15.36±1.20)%〕比较,M组细胞凋亡率〔(4.55±1.10)%〕明显降低(P<0.05);与M组比较,C〔(8.66±1.10)%〕、W组细胞凋亡率〔(12.35±1.10)%〕均明显升高(P<0.05);与C组相比,W组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图2。

图2 各组细胞凋亡(×400)

2.3各组线粒体通路相关指标 与N组比较,M组鼻咽组织中Bcl-2 mRNA表达显著升高,Bax、Cyto-C mRNA表达显著降低(P<0.05)。与M组比较,C、W组鼻咽组织中Bcl-2 mRNA表达显著降低,Bax、Cyto-C mRNA表达明显升高(P<0.05),且W组比C组变化显著。与C组比较,W组Bcl-2 mRNA表达显著降低,Bax、Cyto-C mRNA表达显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组线粒体通路相关指标比较

2.4各组鼻咽组织巨噬细胞中CD68及CD163蛋白表达 与N组比较,M组鼻咽组织巨噬细胞中CD68蛋白表达显著降低,CD163蛋白表达显著升高(P<0.05)。与M组比较,C、W两组鼻咽组织巨噬细胞中CD68蛋白表达显著升高,CD163蛋白表达显著降低(P<0.05),且W组比C组变化显著。与C组比较,W组CD68蛋白表达显著升高,CD163蛋白表达显著降低(P<0.05)。与A组比较,B组CD68蛋白表达显著增加,CD163蛋白表达显著降低(P<0.001)。见表2、图3。

表2 各组鼻咽组织巨噬细胞中CD68及CD163蛋白表达

图3 Western印迹检测各组CD68及CD163蛋白表达

3 讨 论

我国是鼻咽癌发病率最高的国家,且近年来有逐渐上升趋势,对患者的生产生活造成了极大影响,因此探寻一种有效的治疗手段显得尤为重要〔8〕。目前,临床上治疗鼻咽癌的方法不多,效果也不理想,中医治疗鼻咽癌具有使用方便、价格低廉的优势,所以在治疗鼻咽癌方面具有广阔的前景〔9〕。西瑞香素是民间常用中草药了哥王的有效药用成分,其在抗焦虑、降低心肌耗氧量、抗炎镇痛及抗癌等方面都具有重要作用〔10〕。中医认为肿瘤的形成在于“正气虚则成岩,邪之所凑,其气必虚”,鼻咽癌的病因亦然,现代研究表明,中药的药性温和且毒副作用小,其在治疗鼻咽癌方面比单纯使用现代医学治疗更具优越性,发展前景也更广阔〔11〕。而对于鼻咽癌大鼠,西瑞香素可能是通过调节机体阴阳平衡来增强机体免疫力,从而抑制癌细胞的核酸与蛋白质合成,抑制过氧化脂质的形成、促进受损黏膜修复等,进而达到改善局部微循环、抑制肿瘤组织生长的目的,最终使症状得到有效缓解。吕品〔12〕研究表明,西瑞香素对人骨肉瘤、宫颈癌、鼻咽癌等均具有抗肿瘤作用,并可有效抑制乳腺癌细胞增殖,其有望成为新型抗肿瘤药物,具有良好的发展前景。本研究也发现,西瑞香素可明显改善鼻咽癌大鼠病理形态,说明西瑞香素具有很好的疗效。

细胞凋亡是一个多因素、多基因共同调控的复杂过程,是机体维持内稳态的重要组成部分,一旦平衡遭到破坏,就会引发各种疾病〔13〕。而在调控细胞凋亡的相关通路中,线粒体通路占有重要地位,其中Bcl-2等抗凋亡因子及Bax、Cyto-C等促凋亡因子在细胞凋亡线粒体途径中起关键作用〔14〕。鼻咽癌的发生就是多基因表达异常的结果,且目前普遍认为肿瘤细胞凋亡过少是肿瘤持续发展的主要原因,因此如何促进细胞凋亡是临床治疗鼻咽癌的工作重点之一〔15〕。本研究说明,西瑞香素可有效调控线粒体通路,促进细胞凋亡。对于鼻咽癌大鼠,西瑞香素可能是通过抑制原癌基因、促进抑癌基因,来激活相关凋亡信号,从而抑制Bcl-2的表达,刺激Bax 蛋白移位到线粒体外膜并刺激线粒体释放Cyto-C,进而促进凋亡小体的形成,最终达到诱导细胞凋亡、抑制肿瘤生长的目的。张玉静〔16〕研究发现,西瑞香素可显著促进神经母细胞瘤凋亡,抑制其增殖,并能够阻滞细胞周期,降低线粒体膜电位,与本文结果类似。

肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的主要场所,其中免疫细胞是肿瘤微环境中的重要组成成分。巨噬细胞是免疫细胞的一种,目前由巨噬细胞介导的过度免疫反应已被公认为是肿瘤发生发展的第7大标志,而巨噬细胞主要通过极化来对肿瘤的凋亡、转移等方面产生作用〔17〕。CD68和CD163分别是M1型及M2型特异型标志物,通过对其表达的检测,可明确巨噬细胞极化情况〔18〕。而西瑞香素可能是通过影响肿瘤细胞释放信号因子,来破坏微环境平衡,从而抑制巨噬细胞聚集、浸润,进而到达调节机体免疫系统,提高免疫力的目的。本文结果证明,西瑞香素是通过诱导巨噬细胞向M1极化、抑制其向M2极化来达到调控线粒体通路的目的,最终使鼻咽癌症状改善。杨荣刚等〔19〕研究发现,柴胡多糖可显著抑制巨噬细胞向M2巨噬细胞极化,促进M1极化,并显著上调促炎因子分泌,这与本文结果类似。

综上所述,西瑞香素可影响大鼠线粒体通路表达,促进鼻咽癌细胞凋亡,其作用机制可能与抑制巨噬细胞向M2型极化有关。