老年痴呆患者外周血单个核细胞miRNA-16和miRNA-192表达及与认知功能的关系

郑昌江 邹德宇

(丽水市第二人民医院精神科,浙江 丽水 323000)

痴呆是常见的一种造成老年人认知功能障碍疾病。据统计表明,随着老龄化加剧,其患病率呈不断上升趋势〔1,2〕。药物治疗痴呆虽可改善临床症状,生存时间延长,但常需终身服药,患者患有沟通障碍且依从性差,常不配合治疗〔3,4〕。因此,采取及时有效的诊治痴呆方法及评估患者认知功能尤为重要。微小RNA(miRNA)是具有功能性、内源性的一种非编码RNA,其表达参与正常生理过程的调控,还与肿瘤、神经系统、精神系统疾病发生发展等关系紧密〔5〕。近年来,miRNA-16和miRNA-192与精神疾病方面具有关系。本研究旨在探讨老年痴呆患者外周血单个核细胞miRNA-16和miRNA-192表达及与认知功能的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择丽水市第二人民医院于2020年1月至2022年6月老年痴呆患者64例,其中男37例,女27例;年龄61～78岁,平均(70.42±4.15)岁;病程1～15年,平均(7.87±1.49)年;根据患者认知功能障碍情况分为轻度组(n=29)与中度组(n=35)。另选择同期老年健康体检者60例为对照组,其中男36例,女24例;年龄60～76岁,平均(68.98±4.62)岁。各组性别、年龄无统计学差异(P>0.05)。纳入标准:(1)符合第3版中国精神障碍分类与痴呆诊断标准;(2)年龄≥60岁;(3)患者躯体功能正常;(4)获得知情同意。排除标准:(1)合并恶性肿瘤;(2)视听功能不全;(3)合并脑外伤、脑卒中等其他中枢神经系统疾病;(4)存在沟通交流障碍者;(5)心、肺、肝肾功能不全。

1.2主要试剂与仪器 主要试剂:Ficoll淋巴细胞分离液(美国Sigma公司),TRIzol总RNA提取试剂盒(美国Invitrogen公司),反转录试剂盒(大连宝生物工程公司),实时定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(日本Takara公司)。主要仪器:7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.3miRNA-16和miRNA-192表达测定 采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定miRNA-16和miRNA-192表达,采集所有受试者清晨空腹肘静脉血3 ml,依据Ficoll淋巴细胞分离液说明书提取外周血单个核细胞,根据TRIzol试剂说明书提取外周血单个核细胞总RNA,经DEPC水溶解后,总RNA浓度和纯度采用NanoDrop分光光度仪测定。采用反转录试剂盒进行逆转录反应;采用SYBR Premix Ex TaqTM进行荧光定量PCR,测定LncRNA MALAT1表达。总反应体系20 μl:SYBER GREEN 6.8 μl、PCR上游引物 0.4 μl、染料(DYE) 0.4 μl、PCR下游引物0.4 μl、cDNA 2.0 μl、RNase-free H2O 10 μl,混匀,置于实时荧光定量PCR仪扩增。反应条件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40个循环。内参选择GAPDH。采用2-△△Ct法分析结果,△Ct=Ct目的基因-CTU6;△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。由上海生工生物工程有限公司合成引物。miRNA-16上游引物:5′-TAGCAGCACGTAAATATTGGGG-3′,下游:5′-TCAA-CGATACGCTACGTAACGAAAA-3′;miRNA-192上游引物:5′-CTGACCTATGAATTG-3′,下游:5′-GACCTATGAATT-3′。GAPDH上游引物:5′-GAGTCA-ACGGATTTGGTCGT-3′,下游:5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3′。

1.4认知功能评价 采用简易精神状态检查(MMSE)量表评估,评分0～30分,评分越高认知功能越好,MMSE评分≥27分表示认知功能正常,<27分表示认知功能障碍。以MMSE评分21～26分为轻度认知功能障碍,10～20分为中度认知功能障碍,0～9分为重度认知功能障碍。

1.5统计学处理 采用SPSS25.0软件进行t检验、Pearson分析及受试者工作特征(ROC)曲线分析。

2 结 果

2.1各组miRNA-16和miRNA-192表达比较 痴呆组miRNA-16(1.85±0.34)和miRNA-192相对表达量(2.64±0.47)高于对照组(1.00±0.02、1.01±0.02),差异显著(t=19.329、26.834,均P<0.05)。中度组miRNA-16(2.20±0.41)和miRNA-192相对表达量(3.40±0.58)高于轻度组(1.43±0.28、1.72±0.37),差异显著(t=8.585、13.481,均P<0.05)。

2.2两组MMSE评分比较 痴呆组MMSE评分〔(20.78±3.41)分〕低于对照组〔(27.98±0.62)分〕,差异显著(t=16.104,P<0.05)。

2.3miRNA-16和miRNA-192表达与MMSE评分相关性 miRNA-16和miRNA-192表达与MMSE评分呈线性负相关(r=-0.674、-0.586,均P<0.05)。

2.4miRNA-16和miRNA-192对认知功能预测价值 miRNA-16对认知功能预测灵敏度为85.90%,特异度为96.70%,ROC曲线下面积(AUC)为0.954(95%CI0.915～0.992),P=0.000;miRNA-192对认知功能预测灵敏度为85.90%,特异度为98.30%,AUC(95%CI)为0.944(0.904～0.984),P=0.000,见图1。

图1 ROC曲线分析miRNA-16和miRNA-192对认知功能预测价值

3 讨 论

痴呆是由遗传、环境等因素引起的一种常见神经内科疾病,具有病程长、逐步进展等特点,易不可逆损伤患者生活质量和社会功能,降低患者日常生活能力,且随着病情发展将逐渐减退患者生活质量〔6～8〕。痴呆患者会表现出不同程度认知功能障碍,而认知功能损害多与炎性损伤、神经变性及神经内分泌有关〔9～11〕。

miRNA在真核生物体中广泛存在,参与细胞增殖、分化、凋亡等过程,且与多种疾病的发生、发展及个体生长发育、机体代谢密切相关〔12〕。多种miRNA的表达在缺血缺氧的生物体内能够发现异常表达〔13,14〕。在大脑缺血再灌注后,缺血区及其周围区的趋化因子、免疫分子、细胞黏附分子、细胞因子及应激蛋白等出现不同变化,且低氧会导致miRNA的异常表达〔15〕。在神经系统发育、成熟及学习记忆等生理功能过程中,突触的可塑性具有重要作用,且认为是构成学习记忆功能的基础。研究发现,miRNA可通过对调控突触可塑性的相关蛋白,以此影响突触的可塑性〔16〕。此外,miRNA也能够通过对树突棘形态调节而调控突触的可塑性。在痴呆、脑卒中及其他脑血管疾病中存在miRNA表达异常〔17〕。有研究证实,miRNA在脑血管疾病中对基因调控过程具有改善作用。在中枢神经系统损伤后miRNAs会出现异常表达,不仅能够刺激炎症、神经元死亡的发生,且还能够促进氧化应激及细胞凋亡〔18〕。故而认为,miRNAs能够作为继发性脑损伤的敏感性生物标志物,可作为痴呆的生物标志物。通过识别生物标志物有利于更好地理解痴呆的致病机制和病因,且可通过发现新的miRNA可能有利于改善痴呆的早期诊断及其发展。目前,关于miRNA-16和miRNA-192与痴呆及认知功能方面研究甚少,缺乏可靠的临床参考依据。本研究表明,miRNA-16和miRNA-192与认知功能明显相关;且对认知功能具有良好预测价值。