禽心包积液-肝炎综合征实验室诊断技术与防控

张云丹，袁林，袁标，沈德林

（1.息烽县农业农村局，贵州息烽551100；2.贵州省畜禽遗传资源管理站，贵州贵阳550001）

禽心包积液-肝炎综合征（HHS)是由Ⅰ群禽腺病毒C 种血清4 型( FAdV-4) 引起禽类的一种传染性强、 发病率和死亡率较高的急性传染病，以鸡和火鸡为主，该病可通过水平和垂直两种方式传播，典型的解剖临床症状主要表现为严重心包积液和肝炎。该病因最早在1987 年，在巴基斯坦安卡拉地区发现此病， 因此得名安卡拉病。 目前在我国，该病流行范围广，在我国湖北、黑龙江、河南、辽宁等地区呈大面积流行暴发，主要临床症状有精神萎靡，被毛粗乱，无光泽，双眼微闭，拉稀粪，剖检发病鸡以心包内积有大量淡黄色清亮液体，心肌柔软萎缩，肝脏肿大并伴有炎症性坏死，肺脏红肿，肾脏肿大充血，鸡群一旦发病， 成年鸡病死率可达30%以上，3～6 周龄的肉鸡最为易感，病死率最高达80%，给家禽养殖企业的健康发展造成了严重的经济损失和潜在威胁。 为降低家禽养殖企业感染风险，本文就禽心包积液-肝炎综合征（HHS)的诊断技术和防控进行阐述，以期为实验室诊断技术研究和预防提供更多理论参考。

1 HHS 临床症状和病理组织学观察

1.1 临床症状

FAdV-4 是引起HHS 的病原， 发病鸡一般呈隐性感染，初期正常采食，精神状态良好，3～4天后，鸡群突然发病，主要特征是身体摇晃，双眼微闭，被毛粗乱，行动迟缓，精神萎靡，聚集扎堆。还有研究表明，发病鸡部分有水样腹泻，排黄绿色黏稠粪便，部分鸡突然倒地并伴有角弓反张等神经症状，数分钟后死亡。

1.2 病理变化观察

临床病例经剖检观察可见呈淡黄色清亮的心包积液，心肌苍白柔软伴有瘀血点；肝脏肿大发黄，并伴有不同程度的出血和坏死，边缘质脆易碎；肺脏水肿充血；肾脏肿大出血；胸腺和法氏囊先肿大后萎缩。 通过显微病理变化观察，病毒主要引起肝组织的变化，肝细胞内出现嗜酸性或嗜碱性包涵体，出现空泡化肝细胞，肝实质中出现不同程度的坏死灶，偶尔可观察到肝小叶中央部位有细胞弥漫性肿胀； 而心肌显微病变不明显，偶有淋巴细胞浸润和血细胞聚集；有研究发现，肺脏有灶性坏死，部分区域有炎性细胞浸润；小肠上皮细胞有坏死脱落， 肠黏膜出现炎症；肾小管坏死、弥漫性出血，肾间质聚集血细胞；胸腺和法氏囊内的淋巴细胞溶解变性形成空囊状，胸腺小体溶解。

2 HHS 的实验室诊断技术

2.1 病毒的分离与鉴定

病毒的分离鉴定是实验室常用于确诊病毒的重要方法，该方法分离病毒准确度高、易掌握，是分离病毒确诊HHS 的最佳方法之一。 研究表明，Ⅰ群禽腺病毒的培养增殖对动物种属的选择有严格要求，一般选同源动物组织细胞进行分离试验，如鸡胚肾细胞、鸡肝癌细胞、雏鸡肾细胞等，在这些细胞中，鸡肝癌细胞中分离效果最佳，能引起明显的CPE，CPE 主要是细胞变圆、折光性变强、后死亡脱落等。除了用细胞分离外，还可以接种SPF 鸡胚， 该方法也被广泛应用于Ⅰ群禽腺病毒分离， 接种途径主要有尿囊腔接种、绒毛尿囊膜接种和卵黄囊接种等，但接种后鸡胚一般不出现CPE， 尿囊腔接种病毒后鸡胚不死亡。王小辉等研究显示， 经卵黄囊接种的鸡胚24 小时后出现死胚，鸡胚卷缩矮小，畸形发育，胚体有充血、肝炎等症状。

2.2 血清学诊断方法

血清学诊断方法被广泛用于病毒病的诊断， 目前应用于HHS 的血清学诊断方法包括病毒中和试验、 琼脂凝胶扩散试验和ELISA 等技术。病毒中和实验是根据抗原和抗体结合原理建立的诊断技术，可检测血清中的抗体，也可以从病料中检测出病毒，可实现对禽腺病毒分离株的鉴定。

琼脂凝胶扩散试验（AGP）是一种检测抗原或抗体的检测技术。 利用可溶性抗原与抗体在1%～2%琼脂凝胶中自由扩散原理， 发生特异性结合形成抗原抗体复合物，并出现肉眼可见的沉淀线即可诊断。智海东等用禽腺病毒I 型制备琼脂扩散抗原， 并对抗原的特异性和效价进行优化，结果显示制备的琼脂扩散抗原具有良好的特异性，可检测到1∶8 稀释的禽腺病毒I 型阳性血清。 AGP 操作简单，试验成本低，周期短，被广泛应用于FAdV 的抗体检测。

酶联免疫吸附试验（ELISA）因特异性强，操作简单、时间短，因此，该方法在实验室种常用于确诊HHS。张曼采用纯化的FAdVⅠ流行株制备包被抗原，试验结果表明，建立的EISA 检测方法特异性好，对禽流感病毒、鸡新城病毒、沙门氏菌和大肠杆菌等阳性血清检测结果都为阴性，敏感性高达1∶1200， 临床样本检测阳性率达到51.3%。

2.3 PCR 检测方法

PCR 方法是目前在实验室最常用的一种检测方法，与其他方法相比，该方法操作简单，只需要自己设计一对特异性引物和配备一台PCR 仪器，就能够确诊出HHS，同时又可以不同血清型设计出不同的特异性引物，可以检测出不同血清型的HHS。肖跃强等建立的通用PCR 方法，能特异性的检测FADV-Ⅰ的所有血清型 （包括4、8a、8b 和11）， 并证明该方法与病毒分离的符合率达到100%。 郑鸣等（2018）设计禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒4 型(FAV-4)三种病毒的特异性探针，标记于不同大小拟南芥TOC1 基因片段两端，成功建立了能特异性诊断三种病毒的三重环介导PCR 检测方法。

荧光定量PCR （q-PCR） 方法是在普通的PCR 技术上发展起来的一种核酸定量检测技术，该方法与传统PCR 相比，更快速、灵敏、特异， 因此更受青睐。 文艳玲等以六邻体基因（hexon） 保守序列设计引物建立了SYBR GreenⅠ荧光PCR 方法，能成功检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型。

2.4 核酸探针诊断方法

核酸探针方法相较于以上方法，要求技术、设备和成本都高，一般主要应用于更深的科研研究，如疫苗研发、HSS 发病机制机理等，实验室用该方法确诊HSS 很少，因此，该方法不常用于临床检测。董婷婷等用地高辛标记的包涵体肝炎病毒核酸探针，并进行了探针的特异性和灵敏度的评估试验，结果显示核酸探针特异性好，无交叉反应，最低检出量达到5 皮克。

3 综合防控措施

目前， 预防该病最有效的手段还是疫苗免疫，但目前缺乏商品化疫苗。 因此加强养殖场综合管理措施和疫病净化是最佳方法。

3.1 优化引种流程，改善养殖环境

目前，我国的养殖场种源来源一是由外地引进， 在引进的过程中其实存在诸多不确定因素，就以HHS 疾病来说，该疾病无商品化疫苗，不可能保证引进的雏鸡中没有带毒病原，因此，在引进的过程中要做到：第一，在种源场地未发生过HHS 疾病，且其他疫苗均已经免疫完成，并免疫率符合国家标准；第二，引进的工具一定要做好消毒措施，如车辆可以用苯扎溴铵等消毒水进行洗消，保证在运输的过程中无污染；第三，引进的雏鸡一定要做好生物安全隔离，隔离场地要进行全面的消毒，做好保温通风措施，隔离时间一般在30 天左右。 二是自繁自养，因为HHS 疾病可通过种蛋垂直传播， 育种过程中， 一旦有发生HHS 疾病的种鸡、种蛋一定要淘汰处理，同时种场圈舍做好消毒工作，防止传染扩大，造成更大的损失。

3.2 加强饲养管理，提升鸡群免疫力

成年鸡感染FAdV-4 不表现明显的临床症状，病毒会通过垂直传播而延续，水平传播形成大规模流行，造成严重的经济损失，因此做好种鸡种蛋的病原净化工作，是防止FAdV-4 在鸡群中垂直传播的重要措施。 有研究表明，黄曲霉菌混合感染也会引起心包积液和肝炎的典型症状，并加重单独感染鸡的组织损伤程度，因此加强饲养管理就显得尤为重要，如避免使用霉变饲料的同时，使用含有微量元素和维生素（B、C、K 等）的饲料， 提高鸡群免疫力是预防该病的重要手段。刘东等（2015）对我国鸡群中FAdV-4 开展流行病学调查发现， 鸡传染性贫血病病毒（CAA）、传染性法氏囊病病毒 （IBDV） 和新城疫病毒（NDV） 等一些免疫抑制性病原会增强FAdV-4的致病性，对FAdV-4 的感染产生协同作用。 因此，做好鸡舍的清洁消毒、减少协同发病病原菌的数量及做好全面综合防控尤为重要。