甲醛和β-丙内酯对禽流感病毒血凝抑制抗原灭活效果的比较

张娜，刘兴刚，牛亚丽，王亚楠，姜东，李娥，余海涛

（豪威生物科技有限公司，天津 武清 301700）

1992 年，H9N2 禽流感病毒（AIV）在广东地区首次发生，随后向其他地区蔓延[1]，1998 年，扩散到部分省份[2]，已成为鸡群中流行的禽流感病毒的主要亚型[3]。禽流感的防治目前主要采用的是灭活疫苗进行免疫接种，灭活疫苗效力检验一般采用抗体检测的方法。禽流感抗体检测通常采用血凝抑制方法（HI）、琼脂扩散检验法（AGP）和ELISA 方法，其中HI 以其简便、快捷、经济的优点成为最常用的检测方法。

为保证检测环境不被污染，HI 检测所需要的禽流感抗原需要经过灭活处理。甲醛作为最常用的一种灭活剂，广泛用于灭活疫苗的生产中[4]。甲醛灭活作用于病毒核酸的同时也作用于壳蛋白，可能破坏病原体蛋白的抗原性。据文献报道，β-丙内酯具有对H9N2 灭活能力强、对HA 效价影响小且在机体内极易水解成无残留、无害产物等优点[5]。因此，本文通过将H9N2 病毒接种SPF鸡胚，收获尿囊液，分别用甲醛和β-丙内酯进行灭活、冻干，并在不同温度条件下进行保存，定期进行病毒HA 效价检验。结果表明，与甲醛灭活效果比较，采用β-丙内酯灭活的方法对病毒HA 效价影响更小，稳定性也更好。

1 材料

1.1 毒种

禽流感病毒（WD 株）毒种（效价107.63EID50/0.1 mL），由豪威生物科技有限公司提供。

1.2 SPF 鸡胚

购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.3 检验用试剂和试剂盒

禽流感病毒（AIV）H9 亚型HI 试验用阳性血清购自哈尔滨维科生物技术开发公司，阴性血清购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司；鸡减蛋综合征阳性血清及鸡新城疫红细胞凝集抑制试验（HI）用阳性血清购自中国兽医药品监察所。

1.4 无菌检验用培养基

购自北京中海生物科技有限公司 。

1.5 主要仪器

生物安全柜（型号BSC-1100-L ⅡB2）购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；移液器购自Sartorius、eppendorf、RAININ；孵化器（FQ-1）购自黄石市恒丰医疗器械有限公司；管式离心机（型号GQLY-125N）购自辽宁富一机械有限公司；医用离心机[TD3(800B)] 购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，膜包（100 k）购自密理博公司；真空冷冻干燥机（GZLY-0.2）购自奥特佳美科技（北京）有限公司； 高压蒸汽灭菌器 （型号为MOST-L 型） 购自山东新华医疗器械股份有限公司；电热恒温培养箱（DHP-9272B） 购自上海一恒科学仪器有限公司；

2 试验方法

2.1 抗原制备

禽流感毒种稀释5 000 倍，接种10 日龄SPF鸡胚300 枚，培养至72 h，弃掉48 h 前非特异性死亡鸡胚，至4 ℃放置12~24 h，无菌收获尿囊液（每胚预计收获10 mL），混匀后测定血凝价，HA 应≥1:29。

2.2 抗原澄清浓缩

先将收获的禽流感病毒液分别经管式离心机按照 10 000 r/min 转速，离心澄清。再利用蠕动泵提供动力，采用100 k 膜堆对澄清后的禽流感病毒液进行浓缩。病毒液在经过膜包时小分子物质经膜包的内壁渗透出来成为滤出液，而病毒液中的病毒蛋白等大分子物质则得以保留并返回至浓缩罐中。依此往复循环将禽流感病毒液浓缩至原体积的 1/4 终止，收集浓缩后病毒液并测定血凝价。

2.3 灭活

2.3.1 甲醛灭活 取浓缩后的一半抗原，按原量的1%加入4 倍稀释后的甲醛，37 ℃灭活24 h，中间摇3~4 次，收至2~8 ℃保存，按现行版《中华人民共和国兽药典》做无菌检验及灭活检验，并测定血凝价[6]。

2.3.2 β 丙内酯灭活 取剩余的一半抗原，按抗原量的1/4000 加入β-丙内酯，2~8 ℃灭活24 h，中间摇3~4 次。

2.4 抗原检验

灭活后的抗原做无菌及灭活检验，测定血凝价，HA 应≥1:29。

2.5 保护剂配制及冻干

冻干保护剂配制：按照最后的配苗总量测算，冻干总量中含明胶0.8%、蛋白胨1%、蔗糖3% ，高压条件116 ℃ 40 min，将配好的保护剂与灭活抗原按2:3 比例混匀分装至西林瓶中，每瓶2 mL，冻干，冷冻保存，备用。

2.6 检验

2.6.1 真空度测定 按现行版《中华人民共和国兽药典》检验[6]，应出现辉光。

2.6.2 物理性状 眼观冻干抗原物理性状是否为白色海绵状疏松团块，是否易与瓶壁脱离，加稀释液后是否迅速溶解。

2.6.3 无菌检验 按现行版《中华人民共和国兽药典》检验[6]，应无菌生长。

2.6.4 特异性检验 将制备的抗原分别对鸡新城疫阳性血清、禽流感（H9 亚型）阳性血清、鸡减蛋综合征阳性血清进行HI 试验[6]，鉴定其对本病毒产生的抗体反应的特异性。

2.6.5 稳定性检验[7]将冻干好的抗原，分别在4、-20℃条件下保存，并于1 d 和1 、3、6 、9 、12 、15、18 、21 、24 个月各拿出1 支，进行HA测定，每个时间段均要进行2 次重复测定，评价不同保存温度及时间对不同灭活剂灭活的禽流感抗原血凝效价的影响。

3 结果

3.1 抗原制备结果

禽流感（WD 株）毒种接种SPF 鸡胚300 枚，培养后收获鸡胚液约3 300 mL，测定血凝价，离心浓缩至约800 mL，再测定血凝价，400 mL 经甲醛灭活，400 mL 经β-丙内酯灭活，测定血凝价，无菌检验及灭活检验结果均合格，如表1 所示。甲醛灭活后，HA 可达10log2；β-丙内酯灭活，HA 可达11log2。

表1 禽流感（WD）株抗原制备检验结果

3.2 分装冻干

将配制好的保护剂分别与两种灭活抗原按2:3比例混匀，分装至西林瓶中，每瓶2 mL，冻干。

3.3 抗原检验

3.3.1 真空度测定 两种抗原各取40 瓶进行真空度测定，全部出现紫色辉光，表明结果合乎规定。

3.3.2 物理性状 眼观冻干抗原，物理性状为白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，结果显示符合规定。

3.3.3 无菌检验 按现行兽药典进行抽样检验，各组检验10 瓶，结果显示均无菌生长。

3.3.4 特异性检验 将制备的抗原分别对鸡新城疫阳性血清、禽流感（H9 亚型）阳性血清、鸡减蛋综合征阳性血清进行HI 试验，结果表明各毒株对本病毒产生的抗体反应均有特异性，禽流感（H9亚型）阳性血清效价为1:29，ND、EDS 均为阴性。

3.3.5 稳定性检验 不同保存温度对不同灭活剂抗原血凝效价的影响（表2），每次用新开封抗原，减少反复冻融对其影响。

表2 温度和时间对甲醛和β- 丙内酯灭活抗原血凝效价的影响

通过表2 可知，甲醛灭活冻干后的抗原-20℃保存至3 个月HA 开始下降，2~8℃保存至6 个月HA开始下降；β-丙内酯灭活冻干后的抗原2~8 ℃及-20℃放置18 个月效价均无变化，到21 个月效价略有下降，说明β-丙内酯灭活的H9 亚型禽流感抗原保存时间长，稳定性好。

4 讨论

HI 试验可以用于以下几方面： 第一，检测血清中的抗体水平； 第二，鉴定病毒的类型及亚型；第三，辅助诊断病毒性疾病； 第四，作为适时实施免疫的依据，从而避免免疫空档期及重复免疫造成的损失。抗原质量的差异对禽流感 HI 试验结果准确性起到了决定性作用。

目前国内许多禽病灭活疫苗都用甲醛作灭活剂。对灭活疫苗的生产起到一定的作用，血凝抑制用抗原制备往往也用甲醛进行灭活。甲醛既可作用于病毒核苷酸碱基（如A、G、U），又可作用病毒壳蛋白。作用于病毒壳蛋白时，易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集，故不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样，病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏，并可能有病原体存活的概率；用甲醛灭活时间长，一般需要在37~39 ℃处理24 h 以上或更长时间。在本抗原的研制过程中，前期使用甲醛进行灭活，验证显示，甲醛灭活后抗原效价受影响大，且不稳定，保存期短，给生产中带来一定困扰。β-丙内酯是一种有机化合物，用作杀菌消毒剂具有对H9N2 灭活能力强、HA 效价影响小的特点[5]。β-丙内酯易水解，无残留，水解后无危害；可直接作用于病毒或病原核酸，改变病毒核酸结构达到灭活目的，不直接作用于蛋白，且灭活效果理想，灭活时间短，能缩短疫苗生产周期。因此，自1984 年β-丙内酯作为狂犬疫苗灭活剂使用以来，已成功并广泛地应用于多种人和动物疫苗的生产。

本试验共制备出了符合要求的H9 抗原190瓶；通过对比甲醛灭活和β-丙内酯灭活禽流感抗原的效价，结果显示甲醛灭活的抗原冻干后效价下降，2~8 ℃可以保存6 个月，-20 ℃仅可保存3 个月；β-丙内酯灭活的抗原冻干后HA 保持不变，在2~8 ℃及-20 ℃均可以保存18 个月，效价无变化，具有保存时间长、稳定性好的优点可用于实验血清抗体检测。本研究建立了血凝抑制抗原制备方法，为相关抗体检测和不同毒株的交叉保护试验奠定了基础。