防治鸡大肠杆菌病复方中药口服液的筛选*

2023-10-22刘月月林树乾王林张天莲殷斌杨世发黄中利

家禽科学 2023年10期

刘月月，林树乾，王林，张天莲，殷斌，杨世发，黄中利**

（1.山东省农业科学院家禽研究所，山东济南 250100；2.动物保健品山东省工程研究中心，山东济南 250100；3. 济南亿民动物药业有限公司，山东济南 250105；4. 济南新旧动能转换起步区大桥街道办事处，山东济南 250021）

鸡大肠杆菌病是严重危害养鸡业健康发展的主要疾病之一，主要表现为精神萎靡、发热、饮水增加、腹泻、死亡等症状，剖检可见肝周炎、心包炎、气囊炎、胃肠炎等[1-2]。按中兽医理论进行辨证，鸡大肠杆菌可辨为湿热蕴结（胃、肠、肺、肝）引起的湿热证，治疗原则宜侧重于清气血分热、利（燥）湿止痢、凉血止血为主[3-4]。目前，关于中药在治疗大肠杆菌病的生产中有诸多报道，其中研究证实味甘或酸或苦、性寒或平、归胃经或心经或肝经、凉血止血或清热解毒类中药可降低该病的发病率和死亡率，如以白头翁、黄连、黄柏和秦皮四味药组成的白头翁汤在治疗仔猪黄白痢、禽大肠杆菌性腹泻、兔大肠杆菌病等腹泻性疾病均具有良好的疗效[5-7]；而味辛、性温或热、归脾经、祛风类中药效果并不明显。为研制新型抗菌中药制剂，我们以中兽医学理、法、方、药为依据，针对鸡大肠杆菌临床证候和病理变化特征，以清热燥湿止痢、清热泻火健脾止痢、清热燥湿凉血止痢和清热泻火凉血止痢的四个自拟组方（同时设清热泻火、凉血止痢的白头翁口服液做对照），进行复方中药体内外抗鸡大肠杆菌效果的研究，旨在为大肠杆菌病的防治提供新的药材及思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组方及原则阳性药物组（白头翁口服液）：白头翁、黄连、黄柏等成分，由山东昊泰药业科技有限公司生产；清热燥湿止痢（组方1）：郁金、大黄、栀子等成分，由本实验室煎制；清热泻火健脾止痢（组方2）：生石膏、白头翁、儿茶等成分，由本实验室煎制；清热燥湿凉血止痢（组方3）：白头翁、黄柏、茵陈等成分，由本实验室煎制；清热泻火凉血止痢（组方4）：生石膏、千里光、墨旱莲等成分，由本实验室煎制；药材均购于济南市建联中药有限公司，经鉴别符合2020 版《中华人民共和国兽药药典》（二部）要求，加水煎煮两遍，浓缩至1 g/mL生药的口服液。

1.1.2 菌种来源山东省农业科学院家禽研究所分离的大肠杆菌地方株SD 09-29，血清型为O24。

1.1.3 试验动物 19 日龄SPF 公鸡，由山东昊泰繁育公司提供。

1.1.4 试剂牛肉浸膏、蛋白胨、营养琼脂购自北京双旋微生物培养基制品厂。

1.1.5 主要仪器设备 SPF 鸡饲养隔离器，苏州冯氏实验动物设备有限公司产品；超净工作台，济南杰康净化设备厂产品；ZD-85A 数显气浴恒温振荡器，常州普天仪器制造有限公司产品；电子体温计，丹麦KRUUSE 电子体温计；双碟、陶瓦盖、牛津杯等。

1.2 试验方法

1.2.1 药液处理中药口服液6 000 r/min 离心3 min，取上清液121 ℃高压灭菌15 min，4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 菌液制备取0.1 mL SD 09-29 菌液接种5 mL普通LB 培养基，至恒温气浴振荡器中，150 r/min，37 ℃培养过夜，细菌含量为30.0×1010CFU/mL，LD50为4.125×107CFU/mL。

1.2.3 体外抑菌效果的研究采用牛津杯法。制备含0.5%比例菌液的普通营养琼脂培养基平板，待平板凝固后用镊子将牛津杯摆放于凝固好的培养基上，每个牛津杯内加入300 μL 的中药。每种药做3 个重复，37 ℃恒温培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，取平均值。

1.2.4 对鸡人工感染大肠杆菌效果的研究 ①分组：选取19 日龄SPF 公鸡，随机分为中药预防组、中药治疗组、攻菌对照组和空白对照组，每组30只鸡，饲养于不同的隔离器内；②攻菌与用药：用药组、攻菌对照组鸡腹腔接种1 000 LD50菌液，空白对照组腹腔注射等量生理盐水。各预防组攻菌前3 d，按2 mL/kg 体重，上、下午两次灌服；治疗组攻菌后，按2 mL/kg 体重，上、下午两次灌服，连用5 d；攻菌对照组与空白对照组灌服等量生理盐水。

1.2.5 最优组方对人工感染大肠杆菌鸡体温的研究 ①药物选取：选取攻菌保护试验效果最好的中药作为试验药；②分组：选取19 日龄SPF 公鸡随机分为药物预防组、药物治疗组、药物预防+治疗组、攻菌对照组和空白对照组，每组5 只鸡。③攻菌与用药：用药组、攻菌对照组鸡腹腔接种1 000 LD50菌液，空白对照组腹腔注射等量生理盐水。预防组攻菌前3 d，按2 mL/kg 体重，上、下午两次灌服；治疗组攻菌后，按2 mL/kg 体重，上、下午两次灌服；攻菌对照组与空白对照组，灌服等量生理盐水。

1.3 数据分析

采用SPSS 10.0 对各组鸡最早死亡时间、24 h和96 h死亡率、肝病变率、心包炎率进行统计分析，结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 复方中药体外抑菌效果的研究

表1 为复方中药体外抑菌效果。从表1 可以看出，以上4 个组方对大肠杆菌体外均有不同程度的抑菌作用，其中组方2、组方3 和组方4 抑菌圈较大，边界清晰，效果明显优于阳性药物组。

表1 复方中药体外抑菌效果单位：mm

2.2 复方中药体内抑菌效果的研究

2.2.1 复方中药对预防大肠杆菌感染效果的研究表2 为复方中药对预防大肠杆菌感染效果的影响结果。从表2 可见，提前给药3 d 后进行大肠杆菌攻毒，组方2 和组方4 在攻菌24 、96 h 的死亡率极显著低于攻菌对照组（P<0.01），且优于阳性药物组；肝病变率中，发现4 种方剂均有一定程度的抑菌效果，其中组方2 和组方4 显著低于攻菌对照组（P<0.01）；心包炎率结果可见，组方1、组方4 显著低于攻菌对照组（P<0.05）。综合以上结果，由生石膏、千里光等为主要成分的清热泻火凉血止痢方剂具有较好地预防大肠杆菌病的效果。

表2 复方中药对预防大肠杆菌感染效果的影响（n=30）单位：%

2.2.2 复方中药对治疗大肠杆菌感染效果的研究表3 为复方中药对治疗大肠杆菌感染效果的影响结果。从表3 可见：感染大肠杆菌后给予上述方剂，在24 h 死亡率和96 h 死亡率方面，组方1、组方4 显著低于攻菌对照组（P<0.01），且优于阳性药物组；肝病变率方面，组方3、组方4 显著低于攻菌对照组（P<0.05）；心包炎率方面，组方3和组方4 的效果也显著优于攻菌对照组（P<0.05）。综上，组方3 和组方4 在大肠杆菌病的治疗上具有很好的疗效。

表3 复方中药对治疗大肠杆菌感染效果的影响（n=30）单位：%

2.2.3 最优组方对感染大肠杆菌鸡体温的影响表4 为组方4 对感染大肠杆菌鸡体温的影响。从表4 可见，用药后各组体温均显著高于空白对照组，且低于攻菌对照组（P<0.05）。说明组方4在鸡大肠杆菌病的预防和治疗方面均有非常好的效果。

表4 复方中药对治疗大肠杆菌感染效果的影响（n=30）单位：%

3 讨论

本研究根据组方原则，自拟4 个组方对鸡大肠杆菌病进行了防治效果观察，并以白头翁口服液作为阳性对照，分别通过体外抑菌效果、死亡时间、肝病变率和心包炎率等指标来评价中药组方的疗效。在体外抑菌试验中，4 个复方中药组方对分离的大肠杆菌均具有不同程度的抑制作用[8]。

为了进一步验证其临床效果，我们采用SPF鸡，对实验室分离到的大肠杆菌临床毒株，进行4 个组方的预防和治疗效果检测。综合临床结果分析，中药预防鸡大肠杆菌效果以清热泻火凉血止痢为主的组方4 效果最好，其次为清热泻火、健脾止痢为原则的组方2，这两个组方均与党参、黄芪能提高机体的非特异性免疫力有关[9-10]；同时方中的生石膏具有清热泻火，除烦止渴功效[11]。研究证实石膏、知母、黄柏等可使动物脑内多巴胺β-羟化酶活性降低，抑制去甲肾上腺素合成[12]，能迅速降低大肠杆菌感染引起的体温升高，故预防效果较好。同时组方2 中配伍的墨旱莲、侧柏叶、地锦草凉血止血功力更强[13-15]，能有效抑制大肠杆菌感染后血管通透性增强引发的渗出和出血，故肝脏病变率、心包炎率、气囊炎率各组最低，虽然阳性药物白头翁口服液中也含有补中益气的黄芪、养阴润燥的黄精、补肝肾的牛膝和固精敛汗的五味子，但清热泻火之药味不足，故而效果不佳。

在大肠杆菌病的治疗试验中，除了组方4，我们还发现清热燥湿凉血止痢的组方3 也有很好的治疗效果，这与组方中白头翁能够清热解毒，凉血止痢，茵陈清肝经湿热，及大肠杆菌主要侵害肝脏相对应[16]；白及收敛止血，与大肠杆菌引起的出血、渗出等病理变化相对应[17]，故而肝病变率、心包炎率最低；苍术和茯苓燥湿、利水健脾[18-19]，与大肠杆菌引起的肠道渗出增加、排稀便相对应，故治疗人工感染鸡大肠杆菌的效果较好。