苹果酸对结肠癌细胞增殖的抑制作用及机制

赵慧芳,李琳琳,关振霆,谭俊珍,张 帅

(天津中药大学中西医结合学院,天津 301617)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是当今最常见的恶性肿瘤之一,在我国其发病率仅次于肺癌及胃癌,位列恶性肿瘤第3位。目前CRC的治疗强调以手术为主,辅以放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等手段。“药食同源”中药既是食品又是药品,具有饱腹之功、疗病之效[1],对降低CRC的发病率和死亡率具有重要的意义。研究表明,覆盆子[2]、马齿苋[3-4]、砂仁[5]等药食同源中药对肠炎及 CRC有治疗作用。苹果酸(Malic acid )是其活性成分之一,抑制肿瘤生长和转移,还可以降低化疗药物的毒副作用,提高化疗药物的使用剂量[6]。但目前关于苹果酸对肠道疾病的治疗效果具体分子机制研究尚少。因此,我们将对苹果酸对CRC的抑制作用及其分子机制进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 细胞株、试剂与仪器人结直肠癌细胞株LoVo、HCT8和HCT116,均保存于本实验室。苹果酸二甲酯(Dimethyl malate, DMM)购自美国Sigma-Aldrich公司,ERK1/2和p-ERK1/2抗体购自Proteintech Group公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人结直肠癌细胞株LoVo、HCT8和HCT116均为贴壁细胞,含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养于含有5%的CO2、37 ℃细胞培养箱中。

1.2.2细胞计数 为了检测苹果酸处理后细胞的增殖情况,将LoVo和HCT8细胞接种于24孔板(1×104个/孔),经不同浓度苹果酸处理后,每24 h使用台盼蓝排除法进行细胞计数,持续4 d,绘制生长曲线。

1.2.3细胞克隆形成 为了检测苹果酸处理后细胞的克隆形成率,将LoVo和HCT8细胞接种于6孔板(1×104个/孔),经不同浓度苹果酸处理后,在5% CO2、37 ℃的条件下培养7 d,加入甲醇固定15 min,结晶紫染色15 min,洗去浮色,晾干,拍照并计算克隆形成率。

1.2.4蛋白免疫印迹分析 不同浓度苹果酸与HCT116细胞分别共同孵育48 h后,收集细胞,RIPA裂解并提取总蛋白,进行浓度测定、电泳、转膜、封闭、抗体孵育,最后使用ECL发光试剂在暗室曝光。

2 结果

2.1 苹果酸对LoVo和HCT8细胞增殖的影响LoVo细胞分别用0、2.5、5及10 mmol·L-1的苹果酸处理,HCT8细胞分别用 0、2、4及8 mmol·L-1的苹果酸处理。细胞计数的实验结果显示,与对照组相比,苹果酸明显抑制LoVo和HCT8细胞的生长速度,且具有剂量相关性,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),见Tab 1 和 Tab 2。说明苹果酸可能抑制结直肠癌的细胞增殖能力。

2.2 苹果酸对LoVo和HCT8细胞克隆形成的影响根据Tab 3、4结果,苹果酸组细胞的克隆形成数明显低于对照组(P<0.01),且呈现剂量依赖性。说明苹果酸对结直肠癌的克隆形成能力具有抑制作用。

2.3 苹果酸对HCT116细胞中ERK1/2磷酸化的影响为了进一步探讨苹果酸抑制结直肠癌细胞增殖的潜在机制,通过免疫印迹实验检测不同浓度苹果酸处理前后的HCT116细胞中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平。结果显示,2、4和8 mmol·L-1的苹果酸明显减小 p-ERK1 /2与 ERK1 /2的比值,见Tab 5。提示苹果酸抑制结直肠癌细胞的增殖有可能与 ERK1 /2 通路有关。

Tab 1 Effect of malic acid on cell proliferation of LoVo cells n=3)

Tab 2 Effect of malic acid on cell proliferation of HCT8 cells n=3)

Tab 3 Effect of malic acid on colony formation level protein level of LoVo cells n=3)

Tab 4 Effect of malic acid on colony formation level protein level of HCT8 cells n=3)

Tab 5 Effect of malic acid on protein level of

3 讨论

CRC是当今世界第四大常见的肿瘤类型[7],我国CRC发病率及死亡率也均呈现明显的上升趋势。CRC的常规临床治疗手段为手术及放化疗等,然而,由于手术应激、放化疗的毒副作用及药物耐药等情况的出现,寻找毒性更低、效果更好的治疗方法仍十分重要。随着研究的深入,药食同源中药在抗肿瘤治疗中的优势逐渐显露出来。苹果酸作为一种药食同源中药单体,本研究发现,苹果酸对CRC细胞的增殖具有明显的抑制作用,有望成为前景可观的抗癌药物。

细胞外信号调节激酶( extracellular signal regulated kinase, ERK)是介导信号转导至核内的重要细胞信号分子,其参与从质膜到胞核的信号转导,是细胞增殖、分化、凋亡等的重要调节因素,在CRC发生发展中起到重要作用[8]。本研究发现,苹果酸明显降低ERK1/2的磷酸化水平,推测苹果酸抑制CRC细胞增殖与ERK1/2通路有关。后续我们将对此分子机制开展进一步研究。