基于丝素蛋白的水凝胶开发及应用研究进展*

毛婉一，刘奕辰，徐青清，葛健文，陈 浩，钱 颖，季 鹏

(泰州学院 医药与化学化工学院，江苏 泰州 225300)

皮肤，作为最广泛的与外界接触的人体器官，包裹于身体表面，直接暴露在外界环境中，容易受到刮伤、碰撞或是更严重的伤害，从而形成伤口。受到创伤后皮肤会先自行修复，但伤口较严重时则需要一些伤口愈合药物的辅助，加快伤口愈合，避免伤口长期愈合不了而导致发炎等，引起更严重的创伤。伤口愈合的生理过程主要包含四个重叠在一起的阶段，分别为：止血、炎症、增殖和组织重塑[1]。这四个阶段是一个连续的整体，使用有效的伤口愈合药物，不仅能加速伤口愈合的速度，还能避免二次感染。理想的伤口愈合药物具有极佳的保湿性、抗细菌感染性、生物相容性和促进血管生成等优异特点。

水凝胶是一种以水为分散介质的凝胶，具有很强的亲水性和三维网状结构。三维聚合物链交联网络的存在，使水凝胶可以在保持完整结构的同时迅速溶胀和吸收大量的水分[2]，为水分、药物分子、营养物质等的传输提供了理想的环境。随着新生物技术时代的到来，水凝胶的发展也进入了新的阶段。水凝胶是伤口愈合药物的理想载体，较高的含水量为伤口提供了极佳的愈合环境。

丝素蛋白(Silk fibroin，SF)作为目前已知的一种天然高分子材料，有着优异的可加工性、生物相容性、可调节的生物降解性、提取成本低、安全性较高等特点，在纺织、服装行业乃至医用建材上都有着广泛的应用。SF由二硫键连接的重链和轻链组成，因其止血性能好、炎症反应低、气体渗透性好等，被广泛用作皮肤修复生物材料。致密的网状结构能有效防止细菌对伤口的感染，同时还能吸收伤口渗出液。良好的生物黏附性对伤口组织的再生、清创都有益。SF降解可控，极其有利于伤口细胞的修复，可有效降低材料耗损，且降解产物对皮肤组织的愈合作用显著。此外，其柔韧性、缓释性、透气性以及透水性能都十分理想，能帮助细胞的黏附和增生，是一种极具发展前景的伤口愈合材料[3]。这些显著的特点让人们对于SF在伤口愈合方面的研究更加深入，同时开始探讨SF与其他材料之间的联系。利用SF制备高质量的水凝胶是目前材料学科的一个热门课题。

1 丝素蛋白水凝胶的交联方法

1.1 物理交联法制备

物理交联法制备SF水凝胶是在温和的条件下，通过改变特定的物理因素，诱导SF分子由无规卷曲结构向β-折叠构象转变，随后通过进一步聚集形成具有三维网络结构的凝胶。这种方法的优势是制备方法简单可控，而且不需要任何的化学交联剂[4]。常见的物理方法有超声波技术、电场作用、使用有机溶剂等[5]，能有效制备SF水凝胶。

1)超声波技术

超声波技术制备水凝胶属于一种简便的、无需添加的物理交联。超声处理通过改变疏水水化作用引发β片层的形成，从而加速负责凝胶稳定的物理交联，在超声波的帮助下，加速SF的分子间作用以诱导SF的结构变化，从而形成水凝胶[6]。透明质酸(hyaluronic acid，HA)大分子链在超声处理过程中不能形成物理交联，不发生凝胶化，因此凝胶化是由SF物理交联控制的。Hu等通过超声波作用实现了将SF水溶液凝胶化，并用于在没有化学交联的情况下捕获混合的、未交联的HA[7]，研究表明，超声功率输出、超声时间和SF浓度的因素会调节水凝胶状态。超声波法相对于其他物理交联法更加快速有效。

2)电场作用

电场诱导SF凝胶化是将电极浸入含有SF并通有25 V直流电源的水溶液中，高电压导致SF溶液的温度迅速升高，在电场作用下只需几秒就在正极形成可见的凝胶。最后，胶束聚集体通过分子链之间的物理纠缠形成SF水凝胶网络[8]。Liu等通过低压电场，在新鲜的SF水溶液中获得了纤维电凝胶[9]。原本SF纤维水凝胶很难形成，然而，通过CaCl2-乙醇-H2O溶解法获得的SF水溶液暴露在直流电中。在低压电场下，溶液开始在正极上凝胶化。在施加低电压的几分钟内，溶液变得不透明，并且在正极周围完全形成了电凝胶。经过检验，制得的SF纤维电凝胶具有更高的压缩应力。研究发现只有在低电压(3～24 V)、低质量分数(≤5.0%)和中性、碱性条件下，SF纤维电凝胶才容易形成。因此电场诱导丝蛋白水凝胶的形成对电压、溶液浓度和酸碱条件有严格的要求。

3)有机溶剂

通过使用有机溶剂，同样可以做到诱导SF凝胶化[10]。Naresh等使用甲醇诱导再生丝素蛋白(Regenerated silk fibroin，RSF)水凝胶的形成[11]，当加入甲醇后，RSF-水-甲醇体系表现为聚合物-溶剂-非溶剂三元体系，甲醇参与与水的质子交换，从而干扰水与RSF的相互作用，导致RSF脱溶，最终RSF从无序形态变为了有序的结晶形态。通过研究得出，乙醇、异丙醇、正丁醇等有机溶剂也有相似效果。其中，有机溶剂的多少是能否形成凝胶和成胶快慢的决定因素。

4)表面活性剂

表面活性剂如月桂酰肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠和泊洛沙姆等可以与SF混合，以加速诱导SF溶液形成水凝胶。SF纳米纤维由无规卷曲到β-片层形式构象的转变主要依赖于表面活性剂固有性质，以及表面活性剂和SF分子在水溶液中的不同相互作用[12]。Wu等使用阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)作为胶凝剂来加速SF凝胶，在低浓度下，SF链之间相互的疏水作用在缔合中发挥主导功能，诱导凝胶化，并使凝胶时间缩短[13]。相反，在较高浓度下，胶束聚集体之间的静电排斥力逐渐占主导地位，凝胶化受到阻碍，甚至无法发生凝胶。此项研究表明，表面活性剂的浓度是SF凝胶能否凝胶、凝胶速度快慢的关键。

综上所述，这些物理交联法通过促进SF分子之间的相互作用，加速β-片层结构的形成，从而加快SF凝胶化，而且实验方法简单、凝胶速度快、不需要任何化学交联剂辅助。不过物理交联法也存在缺陷：制备的水凝胶稳定性比较差，通常较脆且机械性能较差。

1.2 化学交联法制备

利用化学交联方法制备的SF水凝胶具有更高的物理稳定性和机械性能。当前应用于SF水凝胶制备的主要方法有光交联方法、使用酶进行交联制备等[14]。

1)光交联法

光交联法制备SF水凝胶的机理是由于光引发剂吸收能量后形成自由基，该自由基会进攻预聚物的活性基团，活性基团受到进攻后相互之间发生反应，引发相关的聚合物链之间的交联，从而形成SF水凝胶。通过该反应机理可以发现光聚合制备需要有合适的光源，带有活性基团的预聚物以及光引发剂。对于光源的选择，大体可以分为紫外光以及可见光。目前，紫外光作为光源进行制备的报道很多。例如，Zhang等利用紫外光作为光源，制备了PEGDA/SF互穿网状结构水凝胶，并通过改变SF在水凝胶中的含量，研究SF含量对于该水凝胶理化性质的影响[15]。研究表明，该光交联法制备的水凝胶具有较好的生物相容性和力学性能，能够作为生物医学组织材料应用到相关医学治疗上。也有可见光作为光源的研究报道，如Whittaker等在可见光照射下，用钌作为催化剂，使SF分子上的酪氨酸被氧化并发生反应，形成了二酪氨酸交联[16]。此方法制备的水凝胶在发生凝胶化的过程中用时更短，并具有良好的生物相容性，但该方法涉及到金属钌，制备的水凝胶存在潜在毒性，还需要进一步完善相关研究。可见光的危害要小于紫外光，且效率更高，应用可见光作为光聚合的光源条件将是研究的一个重要方向。同样的，也有应用其他光源(如LED蓝光)作为能量来源的相关研究，并且证明可以克服RSF水凝胶生物活性、凝胶效率及凝胶强度三者难以兼具的问题[17]。应用光交联制备SF水凝胶能够控制反应进行，对材料整体或部分进行调控、在未来生物医学应用上具有良好的前景。

2)酶

与上文提到的光交联方法制备SF水凝胶相比，利用酶作为聚合物参与水凝胶的交联制备有着更多的优点。比如，酶参与会减少甚至不产生具有化学毒性的物质[18]。酶化学提供了优异的凝胶速率的微调方法，能更好地控制产生的水凝胶性质，制得的SF水凝胶力学性能优异，能够作为生物材料应用到相关医学治疗中[19-20]。其中，学者Chirila等在有过氧化氢存在下，用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)诱导SF的自交联，制备了相应的SF水凝胶[21]，并且与物理交联方法以及传统化学交联方法制得的水凝胶进行了比较。从化学背景和合成方法、物理和光学性能、酶降解以及作为细胞粘附和增殖底物的相容性等方面进行比较，得出：HRP诱导交联能够显著缩短凝胶时间，增强水凝胶的弹性，并提高细胞相容性。制得的HRP/H2O2水凝胶将应用于人体眼部的组织工程中[22-26]，提高该工程材料的机械强度，使得相关手术的难度降低、安全性有所提高。通过酶交联制备的水凝胶在相关生物工程上展示巨大潜力，我们还需要发现更多的像HRP这样的酶物质，使其应用到人类相关生产生活中。

2 复合型丝素蛋白的制备和伤口愈合作用

前文已经提及了SF水凝胶作为伤口敷料的一些优势，其本身能够吸收伤口的渗出物，保持潮湿的伤口环境，促进抗菌和止血，同时，独特的粘接性能使其能够进一步促进伤口的愈合。但是用于伤口愈合的理想SF水凝胶应该具有极佳的机械性能、生物相容性、抗细菌感染性、止血、低成本、安全性较高等[27]，单一的SF水凝胶显然无法同时满足如此多的要求。令人鼓舞的是，研究发现的复合型SF水凝胶的出现可有效解决。根据SF水凝胶原本的结构和尺寸，与其他优异的材料整合、重塑，合成的新型复合型SF水凝胶被赋予其它一种或多种特征和性能，弥补了传统SF水凝胶在伤口愈合方面的一些不足，加强了功能性，使其更加优异和高效。

2.1 加载FGF1的肝素化丝素蛋白水凝胶

酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)是一种重要的血管生成因子，可以与内皮细胞上的受体相结合，激活细胞内的信号传导，发挥相应的作用，能够影响细胞的分化和迁移等关键功能[28]。研究表明，FGF1可以促进伤口处组织细胞的增殖分化，加速伤口的愈合，是临床上改善糖尿病皮肤溃疡、愈合伤口的理想伤口敷料[29]。肝素属于高度硫酸化的多糖，可以作为一种抗凝剂，将其附加在医学材料表面上能够形成肝素化涂层，不仅使原本的材料表现出良好的抗凝特性，还能够增强血液的相容性。但肝素化材料的不足之处在于，其对金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有一定的促进作用，即可促进细菌的繁殖，所以可能会伴随有血流感染，进而危及生命[30]。He等尝试将肝素共价固定在SF水凝胶表面，经过一系列的冲洗和灭菌后浸泡在重组FGF1上，形成新型的复合型水凝胶伤口敷料。根据伤口愈合划痕实验和细胞增殖实验，对其安全性和伤口愈合效率进行实验评估，发现其极可能成为理想的伤口敷料[31]。肝素附带的细菌感染危机由于SF水凝胶本身所具有的抗菌作用得以解决，且SF水凝胶本身特殊的多孔结构有利于细胞的再生长和生物活性分子的运输。研究还发现，肝素化的SF水凝胶可以维持FGF1在伤口的浓度，刺激伤口的愈合。一系列实验表明，负载了FGF1的肝素化SF水凝胶能够改善伤口愈合的情况，加快伤口愈合的速度，为未来的临床治疗提供了研究思路。

2.2 姜黄素丝素蛋白水凝胶

姜黄素是从姜黄根茎中提取的多酚成分，具有抗氧化和抗菌作用。其独特的化学结构和药理作用已经在许多慢性疾病的治疗中展露效果，如关节炎、炎症、神经性疾病等。更重要的是，其在临床上已经被证实具有治疗癌症的作用，在乳腺癌[32]、肺癌[33]等癌症中已经有了突破性进展。它对于肿瘤细胞的增殖起着抑制作用，可促进肿瘤细胞的凋亡。有研究人员提出，将姜黄素的抗炎和抗菌等特性附加在SF水凝胶上制成新型的复合型SF水凝胶。Zeynep等人尝试利用一种新型的方法制备SF水凝胶，该制备过程称为电凝胶化制备法[34]。在低压直流电作用下，水性重组SF先形成溶胶最后变成水凝胶，他们在这一过程中加入了姜黄素溶液，成功形成了负载姜黄素的SF水凝胶。经过进一步的处理，这种复合水凝胶还被制成了一种3D水凝胶支架。这种水凝胶支架是一种小孔和高孔隙率结构，研究人员对其进行了评估，发现：因为姜黄素的存在，细菌无法粘附在伤口部位，并且细菌生物膜的形成遭到抑制，极大的改善了伤口的愈合环境。制成的水凝胶支架具有高分子多孔的海绵性质，对于血管生成细胞的浸润作用、伤口血管的生成有着促进效果[35]。这种新型的复合型水凝胶制成的支架极大的促进了伤口愈合，生物相容性也很好，对正常细胞没有副作用，有望成为理想的伤口愈合敷料。

2.3 CSMA/SFMA水凝胶

壳聚糖(Chitosan，CS)细胞亲和性较差，但具有良好的止血作用与抗感染活性。SF是一种良好的增稠剂，能够改善CS的细胞亲和性，并增强其机械性能的稳定性。研究发现，将甲基丙烯酰化壳聚糖(Chitosan Methacrylated，CSMA)与含抗生素的SF相结合制得的水凝胶，有加快伤口愈合效率的作用。He等在室温下将CSMA溶解于去离子水中形成4%的CSMA溶液，将SFMA溶解于去离子水中形成20%的SFMA溶液[36]。将上述等量的两份溶液混合后加入0.4%的苯基锂(2，4，6-三甲基苯甲酰)亚磷酸盐(LAP)在黑暗环境下搅拌至完全溶解，在紫外光下照射5 min直至形成水凝胶。最后，将形成的水凝胶浸入40 ℃下单宁酸中24 h，获得单宁酸环境下增强的CSMA/SFMA水凝胶。就促进伤口愈合的水凝胶敷料而言，物理稳定性十分重要。快速降解会导致水凝胶的机械性能降低，而缓慢降解则会导致水凝胶粘在伤口上，不易切除[37]。He等对CSMA/SFMA水凝胶进行了一个月内不同程度的降解性能评估，发现CSMA/SFMA水凝胶降解速率较低，表明该复合型SF水凝胶适用于伤口敷料[31]。随后该实验还通过对CSMA/SFMA水凝胶粘接性能、体外抗氧化性能、抗菌性能与细胞相容性等进行多重性评价，结果均表明CSMA/SFMA水凝胶对于伤口愈合具有良好的促进作用。

2.4 胆绿素/丝素蛋白水凝胶(BVSF)

胆绿素，血红蛋白分解的副产物，是一种颜色呈深绿色的胆色素。近几年来，胆绿素被证实具有抗炎特性、抗氧化性与较高的光热效率[38]，能够作为愈合伤口的生物活性药物。胆红素、胆绿素的生物转化产物，也具有抗炎、抗氧化性与光吸收特性。Qing等人将胆红素与β-环糊精相结合制得复合型生物粘附性水凝胶，但由于胆红素的疏水性，其应用受到一定限制[39]。相较于疏水性的胆红素，亲水性的胆绿素更适合于水凝胶药物的配制。根据Qing等人的制备方法[40]，将2%的SF溶解于去离子水中，再将胆绿素溶解于去离子水中制成不同浓度的溶液，在不断搅拌下将胆绿素溶液滴加于SF溶液中，用异硫氰酸荧光素标记好的溶液在 100 W 的超声波下进行凝胶化，制得胆绿素/SF水凝胶(BVSF)。在治疗过程中发现，当炎症因子过多时，过度炎症反应将会抑制或延缓伤口愈合。通过对BVSF水凝胶的体内研究与病理实验表明，BVSF水凝胶能够附着于伤口处发挥抗炎作用。经过对BVSF水凝胶光热特性与体外滞留时间等的相关结果研究，表明BVSF水凝胶具有刺激细胞增殖、加快伤口愈合的特性。

2.5 银纳米粒颗粒-芦荟丝素蛋白复合水凝胶

银纳米颗粒(Silver nanoparticles，Ag-NPs)作为一种具有广谱抗菌活性的替代品，应用前景广泛[41]。但由于银离子具有不安全性，它的递送导致细胞毒性及其对聚集的敏感性功效丧失，使得临床转化受到阻碍。然而，研究发现，Ag-NPs水凝胶具有卓越的抗菌作用和促进伤口愈合特性，能够减少伤口炎症的产生。同时，芦荟(Aloe vera，AV)作为一种药用植物，一直被应用于抗菌、抗病毒等[42]。许多研究表明，AV因其较为简单的成分和药理活性在促进伤口愈合方面起着重要作用，已被用于预防和治疗皮肤相关疾病[43]。使用伤口敷料是治疗皮肤损害最有效的方法，可用SF以调节伤口愈合，但因其抗菌性和生物活性需要进一步提高，Liu等用Ag-NPs和AV为改性剂，制备了银纳米颗粒-芦荟-SF复合水凝胶(Ag-AV-SF水凝胶)[44]。该研究表明，Ag-AV-SF水凝胶具有良好的物理性质、抗菌能力以及生物相容性，具有促进细胞增殖、迁移和伤口愈合的作用。因此，该凝胶在改善临床治疗中的伤口愈合方面具有巨大的潜力。

3 总结与展望

SF水凝胶的发展不再局限于SF与水凝胶的简单结合应用，已经转变成由多种复合材料制成的新型复合型SF水凝胶。由原本有限的传统功能转变为与其他生物材料相结合而带来的创新型特性，为伤口的安全稳定、快速愈合带来了更多的可能。伤口的愈合是一个动态而复杂的过程，目前临床伤口愈合面临的主要问题是慢性伤口的治疗。慢性伤口停滞在愈合的炎症阶段，组织中生长因子的减少，衰老细胞的增加，高水平的促炎细胞因子等问题抑制伤口的快速愈合，这些依旧是目前伤口管理所面临的艰巨挑战，每年需要花费大量的医疗保健资源。未来，用于伤口愈合的SF水凝胶应仍具有极佳的机械性能、抗细菌感染性、生物相容性、止血、低成本、易制备以及安全性较高等优异特点，并在此基础上持续加以改进，以提高其治疗伤口的效果，SF水凝胶的进一步研究发展终需克服上述难题，在传统SF水凝胶的基础上开发出更多功能型SF水凝胶仍是重中之重。