基于数据库的菌根与施肥对草地植物叶片性状影响的分析

韦文敬，石兆勇，张梦歌，杨爽，杨文雅

（河南科技大学农学院，河南省乡村人居环境工程中心，洛阳市共生微生物与绿色发展重点实验室，河南 洛阳 471000）

氮（N）、磷（P）、钾（K）是草地植物所需的最基本的营养元素［1］，土壤中可供利用的氮、磷、钾含量较少，养分供求不平衡是限制植物自身建设和草地植被群落恢复的重要因素。草地作为陆地生态系统必不可少的组成部分，为人类提供了丰富的畜牧产品和植物资源，具有重要的生态和经济价值［2］。由于长期以来频繁的人类活动以及剧烈的气候变化导致草地生态系统的环境不断恶化，生产能力逐年下降［3］，研究表明，退化草地的土壤养分含量要低于自然草地，并且更易受到N 和P 含量的限制。施肥可以快速、有效的缓解养分限制，提高土壤肥力，改善植物群落结构，促进生产力恢复。Zong 等［4］研究了不同退化梯度下，施肥对高寒草甸的影响，发现氮和磷的添加极大地促进了草类植物的生长。因此，合理施肥是维持草地养分平衡、恢复退化草地的重要管理措施。此外，土壤中养分有效性的变化可能会影响真菌与植物的相互作用［5］，在相对贫瘠的土壤中，植物通过形成菌根的方式扩大对养分的吸收利用，同时为真菌提供生长所必需的碳水化合物。相反，在养分充沛的土壤中，由于要消耗碳水化合物，菌根共生反而不利于植物的生长发育［6］。施肥作为草地生态系统中一项关键的人为活动，直接改变土壤的养分有效性，间接影响植物与真菌的共生。

叶片性状在植物功能的许多方面扮演重要角色，包括光合作用、呼吸作用和蒸腾作用等生理过程以及植物的生物生产力、经济生产力和对极端温度的抵御能力等［7-8］。比叶面积和叶片养分含量作为广泛使用的叶片性状，经常被用作大尺度生物及地理差异的替代指标。例如，比叶面积可以衡量草地群落构建的变化［9］，叶片养分浓度是森林中光合作用季节性变化的重要指标［10］。此外，已有众多研究表明叶片养分含量和比叶面积对土壤养分的变化较为敏感，适宜作为反映植物对养分富集适应策略的指标［11］。如：Wan 等［12］在研究养分添加对叶片氮磷分配模式的影响时发现，叶片N 和P 浓度随养分的添加而增加，且叶片养分含量比总养分浓度更可靠地反映了湿地植物对施肥的适应策略。Kim 等［13］研究了城市森林火灾后施肥在恢复树种养分环境中发挥的作用，发现叶片氮、磷浓度是评价施肥作用的可靠参数。李维军［14］在对草原物种功能性状和群落功能多样性的研究中发现比叶面积可作为氮素添加后的指示性状。因此，通过研究叶片性状对施肥的响应，有助于考察施肥在退化草地修复中发挥的重要作用。

菌根是土壤真菌与植物根系形成的互惠共生体，地球上97%的植物都能与菌根菌形成共生体，并广泛分布于各种生境中［15］。已有研究表明菌根在生态系统中发挥着重要作用，它能改善土壤结构和生物活性，促进植物的生长发育，提高植物的抗逆性，同时可以显著增加根系吸收养分和水分的面积［16-17］，进而对植物的叶片性状产生影响。如邹慧等［18］研究发现西南桦（Betula alnoides）幼苗的叶片养分浓度与菌根对植物的侵染有关。罗杰等［19］通过对烤烟（Nicotiana tabacum）接种丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）发现，AMF 可以明显提高烟叶的氮、磷、钾和镁的含量。李善家等［20］研究发现植物的比叶面积、比叶体积受根际真菌的显著影响。可见，菌根的存在对植物叶片性状有着不容忽视的作用。

根据菌根植物个体间发生菌根共生的频率，菌根状态可以分为OM（专性菌根obligately mycorrhizal）、FM（兼性菌根facultatively mycorrhizal）和NM（非菌根non-mycorrhizal）3 种。其中，OM 植物是指总是能形成菌根的物种，FM 植物在一些生境中能形成菌根而在另一些生境中不能形成菌根，而当一个物种总是没有被发现形成菌根时称为NM 植物［15，21-22］。菌根状态反映了一个物种内是否存在真菌定殖的一致性［23］。植物群落的菌根状态可以被认为是一个生态系统的重要功能特征，它与特定栖息地的生态条件和其在生态系统中发挥的功能密切相关［21］。且在大范围内，关于植物菌根状态的信息可以帮助确定生态系统中菌根共生的重要性。已有科学家展开了菌根状态的相关研究，如Bueno 等［22］基于欧洲植物菌根和地理信息数据库的研究发现，随纬度的增加OM 植物种类所占的比例明显减少，随海拔的增加FM 植物种类所占的比例明显增加。Hempel 等［24］通过研究植物菌根状态与已知生态需求之间的关系，发现OM 物种更倾向于干燥、温暖、高土壤pH 值的栖息地，而FM 物种与OM 物种相比，在区域尺度上具有更广泛的生态偏好。但目前关于不同菌根状态的植物分布的大规模信息仍然稀缺。因此本研究针对全球草地生态系统，探究了菌根状态和施肥对草地植物叶片性状的影响，并在此基础上，分析了两种菌根状态下施肥处理、气候因素和处理年限对草地植物叶片性状的影响路径，从而更好地探究菌根状态对草地植物叶片性状的影响。

1 材料与方法

1.1 数据的获取与整理

在本研究中，全球叶片性状数据来自Firn 等［25］建立的数据库。在不同年份（2007-2014 年）对横跨4 大洲的27 个全球分布的草地站点进行试验，每个试验点采用随机区组设计，大多数试验点建立3 个重复区，划分为10 个5 m×5 m 地块，每个试验点共30 个地块。试验的施肥处理包括3 种植物必需的大量营养元素（N、P 和K）的全因子组合及对照，氮肥、磷肥和钾肥每年施用一次，为避免毒性，研究开始时在含有钾的处理中一次性施用微量营养元素。研究包括的27 个站点的年平均温度变化为0.3～18.4 ℃，年平均降水量为262～1898 mm，跨度较大，能够代表广泛的气候条件。

在此基础上，根据Koele 等［26］在全球范围内研究外生菌根对叶片性状影响时所使用的菌根分类方法和Yang等［27］探索菌根策略与华北灌丛器官化学计量特征关系的方法，本研究将所有形成OM 的植物归为OM 型，其余不能形成OM 型的植物归为NOM 型（FM+NM）。目的是分析菌根状态在不同施肥处理、不同气候因素和不同处理年限条件下对植物叶片性状的影响，探究菌根状态和施肥在草地植物叶片性状中发挥的作用。

根据已发表文献，如Wang 等［28］和Zhang 等［29］，确定了数据库中1974 个样本的菌根类型。在此基础上初步处理发现，同一物种在相同地点同时进行对照处理及施肥处理的样本共有208 对，优势物种为禾本科植物共120 对（其中有97 个OM 植物和23 个NOM 植物），非禾本科植物88 对（其中有59 个OM 植物和29 个NOM 植物），故本研究将其分为禾本科植物和非禾本科植物进一步分析。并以此为基础建立了包含叶片性状和菌根状态的新数据库。

1.2 数据测量

Firn 等［25］对27 个全球分布的站点在2007-2014 年间进行施肥处理，3～4 年后测量叶片性状，利用物种覆盖度确定每个地块中排名前3 到前5 的优势物种来测量叶片性状。测量方法如下：对于选择出来的优势物种，随机从5 个成熟个体中选择5 个发育完全、几乎没有损伤迹象的叶片，将所有叶片组合起来，使用Epson perfection V300 型扫描仪（日本Seiko Epson 公司）和图像分析软件Image J 测量叶面积。然后将所有叶片在60 ℃下干燥48 h，称干重，比叶面积（specific leaf area，SLA）以叶面积除以干重计算。使用TruMac 元素分析仪（美国LECO 公司）测定叶片氮含量，叶片钾、磷浓度参考Duodu 等［30］所使用的激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法进行测定。

1.3 数据处理

为了便于处理和观察，将叶片性状数据进行对数转化。为了确定不同菌根状态的叶片性状是否存在显著差异，采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。为了进一步验证菌根状态对禾本科植物叶片性状的显著影响，使用R 4.0.5 软件对禾本科植物的叶片性状进行线性混合效应模型分析，考察在不同施肥处理下菌根状态、物种及其相互作用对叶片性状的影响，其中菌根状态、物种是固定效应，地点是随机效应。此外，采用双变量相关分析的方法分别构建施肥、气候因素及处理年限关于两种菌根状态的结构方程模型。

2 结果与分析

2.1 菌根状态和施肥对草地植物叶片性状的影响

由图1 可知，在草地植物中，OM 和NOM 植物的叶片性状存在差异，尤其是P 添加处理时，NOM 植物的Ln叶片P 含量为0.76%，显著高于OM 植物的0.50%。其他叶片性状的差异程度相对较小，未达到显著水平，但也多表现为NOM 植物＞OM 植物。可见，草地植物中，NOM 对叶片性状的促进作用优于OM。进一步分析叶片性状对施肥的响应发现，当施用相应的养分作为肥料时，叶片中的N、P 和K 含量显著增加，但SLA 仅在施用NP 和NPK 时显著提高且幅度较小。

图1 菌根状态和施肥对草地植物叶片性状的影响Fig.1 Effects of mycorrhizal status and fertilization on leaf traits of grassland plants

2.2 菌根状态和施肥对不同草地植物类群叶片性状的影响

天然草地中，禾本科植物数量多、分布广，有重要的生态和经济价值［31］。因此，进一步将草地植物分为禾本科植物和非禾本科植物两个类群，分别研究不同菌根状态下两种植物类群叶片性状响应施肥处理的变化。

2.2.1 菌根状态和施肥对禾本科植物叶片性状的影响 在禾本科植物中，叶片N、P、K 含量在OM 和NOM 间随不同的施肥处理，呈现出不同的响应状况；然而在所有OM 和NOM 差异显著的处理中，NOM 总是高于OM（图2）。其中，施用N、NK 及NPK 时，NOM 植物的叶片N 含量显著高于OM 植物（P＜0.05）；施用K 时，NOM 植物的叶片K 含量极显著高于OM 植物（P＜0.01）；对于叶片P 含量而言，NOM 植物在施用P 及PK 时极显著高于OM 植物（P＜0.01），在施用NP 及NPK 时显著高于OM 植物（P＜0.05）。施肥对禾本科植物叶片性状的影响同样表现为施用相应肥料可以显著提高OM 植物和NOM 植物的叶片N、P、K 含量。此外，N 和NP 添加处理可以显著增加禾本科OM 植物的SLA。

图2 菌根状态和施肥对禾本科植物叶片性状的影响Fig.2 Effects of mycorrhizal status and fertilization on leaf traits of gramineous plants

2.2.2 菌根状态和施肥对非禾本科植物叶片性状的影响 在非禾本科植物中，菌根状态虽然会引起叶片性状的差异，但并不显著（图3）。比较非禾本科OM 植物与NOM 植物的叶片性状发现，NOM 植物的SLA 均高于OM植物，但NOM 植物的叶片P 含量却均低于OM 植物。可见，菌根状态对非禾本科植物叶片性状的影响不具有一致的表现。施肥同样可以不同程度的影响非禾本科植物的叶片N、P 和K 含量。但与草地和禾本科植物不同，非禾本科植物的叶片P、K 含量在部分施肥处理中，则呈现出显著的抑制效应。其中，N 添加处理时，NOM 植物的Ln 叶片P 含量为-0.24%；P 和NP 处理时，OM 植物的Ln 叶片K 含量分别为-0.10%和-0.11%。

图3 菌根状态和施肥对非禾本科植物叶片性状的影响Fig.3 Effects of mycorrhizal status and fertilization on leaf traits of non-gramineous plants

2.3 菌根状态对禾本科植物叶片性状的影响程度分析

由图2 可知，不同菌根状态禾本科植物叶片性状对施肥的响应存在明显差异，为了进一步验证菌根状态对禾本科植物叶片性状的影响，使用线性混合效应模型对其影响因素进行分析，结果表明（表1～4）：禾本科植物4 种叶片性状均受到菌根状态的极显著影响（P＜0.001），并且物种及两者的相互作用对绝大部分禾本科植物叶片性状有显著影响。该结果证实了菌根状态确实能够显著影响禾本科植物的叶片性状。

表1 不同施肥处理下菌根状态和物种对禾本科植物SLA 的影响Table 1 Effects of mycorrhizal status and species on SLA of gramineous plants under different fertilization treatments

表2 不同施肥处理下菌根状态和物种对禾本科植物叶片N 含量的影响Table 2 Effects of mycorrhizal status and species on leaf N concentration in leaves of gramineous plants under different fertilization treatments

表3 不同施肥处理下菌根状态和物种对禾本科植物叶片P 含量的影响Table 3 Effects of mycorrhizal status and species on P concentration in leaves of gramineous plants under different fertilization treatments

表4 不同施肥处理下菌根状态和物种对禾本科植物叶片K 浓度的影响Table 4 Effects of mycorrhizal status and species on K concentration in leaves of gramineous plants under different fertilization treatments

2.4 施肥处理、气候因素及处理年限对不同菌根状态草地植物叶片性状影响的路径分析

通过双变量相关分析，使用与叶片性状有显著相关关系的路径，分别构建两种菌根状态的结构方程模型（图4 和图5）。结果表明：无论是OM 还是NOM，施肥与草地植物的SLA 均没有显著的相关关系，只显著影响草地植物的叶片养分含量，且因菌根状态不同，其影响路径也不同。在OM 植物中，施肥处理不仅能促进与其相对应的叶片养分含量，还会对其他叶片养分含量产生影响，其中N、K 添加处理均显著促进植物叶片N 和K 含量；P 添加处理显著促进植物叶片N、P、K 含量。然而NOM 植物中，施肥处理只显著影响与其相对应的叶片养分含量。

图4 施肥处理、气候因素及处理年限对草地OM 植物叶片性状的影响路径Fig.4 Effects of fertilization，climate factors and treatment years on leaf traits of OM plants in grassland

图5 施肥处理、气候因素及处理年限对草地NOM 植物叶片性状的影响路径Fig.5 Effects of fertilization，climate factors and treatment years on leaf traits of NOM plants in grassland.

气候因素和处理年限对草地植物的叶片性状产生了不同程度的影响，并在OM 植物和NOM 植物中表现出相似性，即年平均温度和处理年限都与叶片性状呈显著的负相关关系，年平均降水量与叶片K 含量显著负相关而与叶片N、P 含量和SLA 显著正相关。

3 讨论

本研究基于全球草地植物叶片性状菌根状态数据库探索了菌根状态和施肥处理对植物SLA 和叶片氮、磷、钾含量的影响，比较了不同菌根状态下叶片性状对施肥处理的响应，为菌根状态与植物叶片性状的相关研究提供了参考依据。

通过比较不同菌根状态植物叶片性状对施肥的响应，发现OM 和NOM 植物的叶片性状存在明显差异，尤其是禾本科植物的叶片养分含量，NOM 植物的叶片N、P、K 含量明显高于OM 植物。菌根在植物的矿质养分获取中发挥重要作用的观点已被广泛认可，菌根的类型和状态是影响植物适应环境变化策略的重要因素［32］。相关研究表明，外生菌根（ectomycorrhiza，ECM）植物通常分布在养分循环缓慢的高纬度生态系统中，丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）植物在养分循环迅速的低纬度生态系统中占主导地位［33］。OM 植物种类所占比例随纬度的增加呈明显减少趋势，FM 植物种类所占比例随海拔的增加呈明显增加趋势［22］。此外，菌根状态还会影响C、N、P 在不同器官中的分配，Yang 等［27］研究发现OM 或FM 植物中，茎叶的C、N、P 浓度随着根C、N、P 浓度的增加而增加；NM 植物中，茎叶的N 浓度随着根N 浓度的增加而增加，且最高碳浓度出现在FM 植物中，最高氮浓度出现在NM 植物中。这些研究都表明不同菌根状态的生态偏好可能对植物生长发育产生的影响存在差异，因此，有必要针对不同菌根状态探讨叶片性状对施肥的响应。本研究中，相同施肥处理下，禾本科NOM 植物的叶片性状明显高于OM 植物，可见，相较于OM 植物，NOM 植物更有利于禾本科植物叶片养分的积累。这可能是由于当养分不足时，菌根通过增加根系吸收面积来提高植物对矿质营养元素的吸收，当养分充足时，根系可直接吸收植物自身生长所需要的养分，因此菌根的形成更易发生在土壤肥力较低的生境中［24］。且OM 物种往往与较高的温度、较干燥的栖息地和较高的土壤pH 呈正相关；FM 物种与OM 和NM 物种几乎在所有分析性状上均存在显著差异，主要原因是FM 植物对环境的适应能力更强，具有更广的地理分布［24］。此外，以营养交换为基础建立的菌根在促进植物对养分吸收的同时，也需植物提供其生长所必需的碳水化合物［34］，有研究表明，植物将高达20%的净光合有机C 用于菌根的自身建设［35］。因此总是形成菌根的OM 植物分布范围相对较小，土壤通常较为贫瘠，且需提供大量养分用于菌根的形成和发展，故叶片养分含量远低于NOM 植物。

合理施肥是退化草地修复的重要措施，在考察施肥效果时，叶片性状是常用的可靠指标［11］，由于菌根真菌在养分循环中不可忽视的作用，本研究在两种菌根状态下考察叶片性状对施肥的响应。发现OM 和NOM 植物在短期施肥的影响下都表现为叶片N、P、K 含量显著增加，SLA 提高幅度较小。路径分析结果进一步证实了OM 和NOM 植物的SLA 均与施肥没有显著的相关性。施肥能够快速补充土壤养分，解除由养分限制引起的植物自身建设问题，叶片养分含量与土壤肥力密切相关［36］，这可能是引起叶片养分含量显著增加的主要原因，SLA 与土壤养分没有明显的相关性导致其受施肥影响较小［37］。

气候因素尤其是温度和降水在植物与真菌的互作中扮演重要角色，前人关于菌根状态与气候因素的研究发现OM 物种随着温度范围的扩大而相对增加，FM 物种的比例随着温度范围的增加而持续减少，NM 物种与较高的温度范围相关，且比例随着年降水量的增加而显著降低［23］。Okada 等［38］关于外生菌根生物量的研究发现前一年秋季降水是当年外生菌根生物量的最主要决定因子，且呈负相关关系。可见，气候因素会影响菌根的分布和定殖，本研究分析了不同菌根状态下气候因素对叶片性状的影响，由OM 和NOM 的结构方程模型可以看出，年平均温度和处理年限都与叶片性状呈显著的负相关关系，年平均降水量与叶片K 含量显著负相关而与叶片N、P 含量和SLA 显著正相关。但不同菌根状态草地植物叶片性状受气候因素和处理年限的影响程度存在差异，这可能就是由于生态环境的差异影响了植物与菌根真菌的相互作用［39］。

4 结论

本研究基于全球草地叶片性状数据库，探究了菌根状态和施肥对植物叶片性状的影响。草地植物叶片性状因菌根状态的不同存在明显差异，尤其对于禾本科植物而言，NOM 植物对叶片性状的促进作用显著优于OM 植物。施肥对于叶片性状的影响在禾本科植物和非禾本科植物中都表现为促进叶片养分的积累，但对比叶面积的影响较小。此外，OM 植物和NOM 植物的叶片养分含量都与施肥处理、气候因素和处理年限显著相关，但比叶面积却只与气候因素和处理年限有显著的相关性，与施肥处理无明显的关系。本研究初步探讨了菌根状态和施肥与草地植物叶片性状的关系，可为两者在退化草地修复中可能发挥的作用提供数据参考。