高效液相色谱法测定香花秋海棠药用成分含量

陶仕珍，罗 茜，张静美，刘 强*

（1.云南林业职业技术学院，云南 昆明650224；2.云南现代民族药工程技术研究中心，云南 昆明650501）

秋海棠属（Begonia）植物种类繁多，分布广泛，位列全世界第6 大被子植物科属，目前全世界对秋海棠属的研究、开发和应用主要集中在系统分类学、地理分布、分子生物学、资源保护和园艺观赏等方面［1］。在我国，对秋海棠属植物的传统利用，除了观赏应用外，在其产地还将它们作药用、食用［2］。管开云等［2］对国产26种秋海棠的调查研究发现，有24种作药用，其中8种既被作为民间中药、野生蔬菜和饮料，也被作为饲料加以利用，其中香花秋海棠有药用的记录，可用于止痒，治疗皮肤疥疮，在广西、广东以全草入药，云南仅以根茎入药。在我国220多种秋海棠中有药用用途记载的就有32种，既有内服、也有外用［3］。目前从秋海棠属几种植物全草或根茎中分离得到的主要化学成分有黄酮类、皂苷、强心苷、甾醇等，有关秋海棠属植物成分的研究还较少，应加强对秋海棠属植物化学成分、药理作用、活性成分等方面的研究，才能更广泛地开发其药用、食用价值［4］。

据相关文献记载，香花秋海棠全草可利咽、消食、消肿，用于咽喉肿痛、食滞、跌打损伤［5］，还可用于清热散瘀、消食健胃［3］，但对其生药成分的测定至今未见报道。

高效液相色谱（High performance liquid chromatography， HPLC）法是化学化工和药物行业最常用的仪器分析手段，由于其具有高压强、高效率、高速度、高灵敏度、操作方便、极易回收、可降低样品消耗量等特点，已广泛应用于中药材活性成分测定［6，7］，在秋海棠属药材含量的测定中也有应用［8-10］。本研究采用HPLC法对香花秋海棠中黄酮类、酚酸类化学成分的含量进行测定，以期深入了解香花秋海棠生药成分和药用价值，为其药用资源的开发提供参考。

1 实验材料

1.1 试药

香花秋海棠（Begonia handelii），又叫大香秋海棠、短茎秋海棠，为秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠属植物，是多年生肉质草本，根状茎匍匐，无直立茎，雌、雄异株，花呈白色或粉红色，有芳香气味。生长于海拔100～1 500 m 的森林里遮蔽潮湿的环境中；在我国主要分布于云南、广东、广西、海南；国外在老挝、缅甸、泰国、越南也有分布［11-12］。本实验所用样品香花秋海棠材料来自于云南林业职业技术学院金殿校区林木种苗培育温室内扦插繁殖的植株。

1.2 试剂耗材

甲醇（批号： 1107720708）和乙腈（批号： 210365）均购自默克股份两合公司，甲醇和乙腈均为色谱纯。对照品信息：芦丁（批号： 100080-20181，纯度：91.7%）和儿茶素（批号： 110877-202005，纯度：95.1%）购自中国食品药品检定研究院，表儿茶素（批号： 80460050）购自诗丹德，原儿茶酸（批号： C12977937，纯度：97.0%）和原儿茶醛（批号： C12326334，纯度：98.0%）购自麦克林。微孔滤膜0.45 μm。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱： Z0RBAX SB-Aq（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流动相： 表儿茶素、芦丁测定为乙睛 ∶ 0.2%冰醋酸水溶液 = 18 ∶ 82，原儿茶酸、原儿茶醛、儿茶素测定为乙睛 ∶ 0.2%冰醋酸水溶液 = 32 ∶ 68； 流速： 1 mL/min；检测波长： 280 nm；柱温： 25℃；进样量： 10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备溶液的制备

精密称取对照品原儿茶酸11.94 mg，原儿茶醛10.82 mg，儿茶素5.50 mg，表儿茶素10.47 mg，芦丁10.15 mg，分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得储备液。

2.2.2 对照品溶液的制备

分别精密量取原儿茶酸对照品储备液330 μL，原儿茶醛对照品储备液110 μL，儿茶素对照品储备液1 mL，表儿茶素对照品储备液0.5 mL，芦丁对照品储备液60 μL置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得含有原儿茶酸38.219 94 μg/mL、原儿茶醛11.663 96 μg/mL、儿茶素52.305 00 μg/mL、表儿茶素52.350 00 μg/mL 和芦丁5.584 53 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称取香花秋海棠药材粉末5.0 g 置于具塞锥形瓶中，准确加入200 mL 70%甲醇溶液，水浴回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加适量的水溶解，过聚酰胺柱（0.600 mm ～ 0.150 mm，柱内径1.5 cm，湿法装柱），分别用水、95%乙醇各100 mL洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至25 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，通过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，可得供试品溶液。

2.3 测定方法

参照蒋佳雯和刘卉等人建立的秋海棠属植物成分测定方法［8，9］，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。根据公式（1）计算得测定样品各成分含量。

3 实验结果

3.1 各对照品溶液的峰面积

各对照品溶液重复测定6 次峰面积取平均值，见表1。各对照品平均峰面积用于计算供试样品的对应成分含量。

表1 对照品溶液的峰面积测定Tab.1 Mean peak areas of control samples

3.2 香花秋海棠茎5种药用成分含量

取双样，同时对香花秋海棠茎的化学成分峰面积进行两次重复测定，通过与对照品进行比对，检测出5 种化学成分分别是芦丁、表儿茶素、儿茶素、原儿茶酸、原儿茶醛，经上述公式计算各成分的含量，取其平均值，相对偏差为0.00%～0.15%，均 ＜ 2%，测定结果有效，见表2。

表2 香花秋海棠茎5种药用成分含量测定Tab.2 Determination of five medicinal ingredients in the stems of Begonia handelii

3.3 香花秋海棠叶5种药用成分含量

取双样，同时对香花秋海棠叶的化学成分峰面积进行两次重复测定，通过与对照品进行比对，检测出4 种化学成分分别是芦丁、儿茶素、原儿茶酸、原儿茶醛，经上述公式计算各成分的含量，取其平均值，相对偏差为0.01% ～ 0.12%，均 ＜ 2%，未检测出表儿茶素，测定结果有效，见表3。

表3 香花秋海棠叶5种药用成分含量测定Tab.3 Determination of five medicinal ingredients in the leaves of Begonia handelii

4 讨论

4.1 香花秋海棠的5种药用成分分析

经HPLC 法测定，检测出香花秋海棠茎中的黄酮类化学成分3 种，分别为芦丁（C27H30O16）、表儿茶素（C15H14O6）、儿茶素（C15H14O6）；酚酸类化学成分2种，分别为原儿茶酸（C7H6O4）和原儿茶醛（C7H6O3）。叶中的黄酮类化学成分2种，分别为芦丁和儿茶素；酚酸类化学成分2种，分别为原儿茶酸和原儿茶醛。

检测出茎中5 种药用成分的含量分别为芦丁2.17 μg/g、表儿茶素1.11 μg/g、儿茶素2.73 μg/g、原儿茶酸4.56 μg/g、原儿茶醛1.08 μg/g；叶中只检测出4 种药用成分的含量，分别是芦丁13.44 μg/g、儿茶素4.02 μg/g、原儿茶酸2.01 μg/g、原儿茶醛5.86 μg/g，未检测出表儿茶素。从测定的数据比较发现，茎、叶中各成分含量差异明显：芦丁（叶） ＞ 芦丁（茎），儿茶素（叶） ＞ 儿茶素（茎），原儿茶醛（叶） ＞ 原儿茶醛（茎），原儿茶酸（叶） ＜ 原儿茶酸（茎），表儿茶素只在茎中检测到，见表2、表3。将香花秋海棠茎、叶混合使用药效成分比单一使用丰富，且各成分含量也增高，有利于提高用药疗效。

芦丁具有抗病毒、抑菌、抗炎、镇痛、清除自由基、增强免疫力、抗衰老、抗脂质过氧化、抗急性胰腺炎、抗自由基活性等作用［13-14］。表儿茶素及儿茶素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、保护心血管、调节糖脂代谢、调节免疫力、保护神经系统等作用［15-16］。原儿茶酸具有抗氧化、抗炎、抗高血糖、抗纤维化以及保护心血管和神经系统的作用，还有抗菌、祛痰平喘、解蛇毒的功效［17］。原儿茶醛具有抗菌、抗炎、扩张冠状动脉和抑制血小板凝聚作用［18-19］。香花秋海棠茎叶中测定出了以上5 种药用成分，初步验证了香花秋海棠清咽、消肿、清热散淤、止痒的药用功效，对其药效的进一步研究有一定的参考作用。其疗效是否还与别的化学成分有关，由于无对照品，本次试验无相关的测定，有待后续进一步的研究。

对香花秋海棠5种药用成分芦丁、表儿茶素、儿茶素、原儿茶酸、原儿茶醛的含量测定，为香花秋海棠民间传统药用疗效找到了相应依据，可为今后深入研究该植物药用价值提供一定理论依据。

4.2 与近缘物种药用成分的比较分析

因本次调查采样地位于保护区，且香花秋海棠只是零散分布，数量少，为了保护野生种质资源，只采了几个叶片作为人工繁殖材料供本次实验用。香花秋海棠与秋海棠（Begonia grandis）、中华秋海棠（Begonia grandissubsp.sinensis）的药用功效相近［19-21］。本次测定出人工繁殖栽培香花秋海棠的5种药用成分含量与涂志超等［20］测定的产于湖北宜昌、恩施野生秋海棠以及产于湖北京山市、钟祥市中华秋海棠相比较，人工温室栽培香花秋海棠各药用成分平均含量明显低于野生的秋海棠和中华秋海棠。这反映出药材的产地不同、生境不同，其成分含量有差异，也说明道地药材是药材品质的重要保障，在中药材生产中用尽可能完善的仿野生栽培技术，才能保证药材的品质、药效不降低。香花秋海棠药效成分含量是否与产地、生长环境、栽培技术等因素有关，还有待下一步做深入的测定分析。