LncRNA CUST_49525和CUST_47163在急性髓系白血病患者外周血中的表达及其诊断意义

高 冉，哈丽亚·塔力达吾别克，刘晓东，田 薇

(新疆医科大学公共卫生学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是血液系统高发的恶性肿瘤之一，其特征是骨髓和外周血中尚未成熟的干细胞增殖失控、凋亡受阻，造血功能异常，且具有高度异质性[1]。近年来，虽然AML 治疗和抑制方法的研究取得了显著进展[2]，提高了患者生存率。但是诊断、治疗和预后的检测效果仍然不够理想[3]。AML 是环境、遗传以及多种因素共同作用的结果，从分子层面探究AML的复杂发病机制，能够为AML诊断标准提供新的方向。

在人类转录本中，80%～90%的RNA 均不编码蛋白质，被称为非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，其中长度超过200个核苷酸的ncRNA被称为长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)[4]。LncRNA 可以在转录或转录后、翻译或翻译后多重水平调控基因的表达。研究表明，LncRNA 参与生物体生长发育、免疫、代谢等多种生命活动过程[5]。也参与癌症的发生与发展[6]，其在肿瘤中的作用主要是对癌基因和抑癌基因的调控。比如Fu 等[7]发现LncRNA EPEL 可通过与RUNX2 相互作用来调节癌细胞行为并影响胃癌的预后。实际上已有研究[8]表明LncRNA有望成为AML病情演化及诊断的潜在生物标志物。

本课题组前期采用微阵列分析对AML 患者和健康对照组人群外周血淋巴细胞基因表达的差异进行鉴定[9]，筛选出了431 个差异表达的LncRNA，其中173个表达上调，258 个表达下调。LncRNA CUST_49525和CUST_47163 被认为在AML 患者体内表达异常。因此，本研究通过实时荧光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)检测AML 患者和健康对照组人群外周血LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 的表达水平，采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)评估其预测能力，并结合微核率研究其诊断价值，进而为AML诊断辅助指标提供研究线索。

1 材料与方法

1.1 研究对象

课题组选取AML 患者35 例，均来自山东省临沂市，其中男性17 例，女性18 例，平均年龄(44.14±18.46)岁。AML 组患者均通过骨髓涂片形态学和细胞化学研究确诊为AML。健康对照组共47例，均来自上海市某厂后勤和行政管理人员，均知情同意，其中男性30 例，女性17 例，平均年龄(47.11±9.14)岁。健康对照组人群符合以下标准：无癌症诊断史；无伴全身免疫系统疾病和感染性疾病；排除孕妇和哺乳期女性。从每名受试者采集2 mL 空腹外周静脉血用于qPCR检测。

1.2 实验试剂与仪器

淋巴细胞分离液购自天津灏洋华科生物科技有限公司，TRIzol 购自美国Life Technologies 公司，miRNeasy 迷你试剂盒、QuantiNovaTMSYBR®Green PCR 试剂盒均购自德国Qiagen 公司，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 购自日本TaKaRa 公司；氯仿购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量PCR 检测LncRNA 的表达用淋巴细胞分离液分离出外周血中的淋巴细胞，利用miRNeasy 试剂盒进行RNA 提取，并测定纯度和浓度，然后进行反转录获得cDNA，设定反转录程序为37 ℃、15 min；85 ℃、5 s；4 ℃保存。以上述cDNA 为模板，GAPDH 为内参，按照qPCR 试剂盒操作指南配制反应体系，设置PCR 程序为：95 ℃、1 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、1 min，共40 个循环。用目的基因的表达水平相对于GAPDH 的水平进行定量。实验过程中，所有样本均采用3 个复孔，采用2-ΔΔCT法计算LncRNA的相对表达水平。依据基因芯片提供的信息，获得目标LncRNA 全长基因序列，其中引物的设计及合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.2 胞质分裂阻滞微核试验从外周血样本中抽取0.5 mL全血置于含有肝素的抗凝培养瓶中，采用胞质分裂阻滞法处理，充分混合后，37 ℃、CO2体积分数为5%培养箱中培养，44 h 后加入终浓度为6 μg/mL的细胞松弛素B，继续培养28 h后收集细胞，低渗处理，用甲醇和乙酸以3∶1比例(V∶V)混合液固定，将处理好的细胞置于载玻片上风干过夜，用Giemsa染色后，在显微镜下观察1 000 个双核细胞中含有微核的淋巴细胞个数，计算微核千分率(‰)。

1.4 统计分析

数据整理及分析采用SPSS 26.0 软件，数据图绘制采用GraphPad Prism 8.0 软件。两组之间比较采用非参数Mann-WhitneyU检验，ROC 曲线分析差异表达的LncRNA CUST_49525和CUST_47163及淋巴细胞微核千分率在AML 诊断中的价值，ROC 曲线下面积(area under curve，AUC)用于评价诊断价值指标，取约登指数最大的取值为Cut-off值，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 AML 患者与健康对照人群外周血中LncRNA 的表达及微核分布

结果见表2 和图1。与对照组相比，LncRNA CUST_49525和CUST_47163在AML患者组人群外周血中的相对表达水平均明显下调(均为P<0.01)，而AML患者组双核淋巴细胞微核率显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1 外周血中LncRNA CUST_49525和CUST_47163的相对表达水平和微核率分布

表2 两组人群LncRNA CUST_49525、CUST_47163 表达和微核率差异

2.2 LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 及微核率在AML中的诊断价值分析

在单一变量的诊断价值评估中，淋巴细胞微核率的表现效果是最佳的。将LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 及微核率作为自变量，以AML 的诊断结果为因变量，构建二元Logistic回归，每个研究对象得出相应的预测概率，以预测概率绘制ROC曲线，用于AML 的联合诊断(见表3，图2)，所得AUC 为0.970，95%CI 为0.931～1.000。与对角线下面积(0.500)相比，CUST_49525、CUST_47163、微核率和联合诊断各组AUC 均增大，差异具有统计学意义(P<0.01)。三项联合诊断效果优于单一指标诊断，单一指标诊断中微核率优于其他指标(P<0.01)。

图2 LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 及微核率诊断AML 的ROC曲线

表3 LncRNA CUST_49525和CUST_47163及微核率在AML诊断中的价值分析

3 讨论

近年来，AML是成人白血病的最常见形式，其死亡率居高不下，严重威胁患者的生命健康。然而，当前我国在AML诊断、疗效和预后的判断中最常用的是流式细胞术检测和骨髓穿刺涂片，除此之外，细胞组织化学染色也可用于形态学诊断[10]。在实际应用中，骨髓穿刺取材具有一定局限性，患者组织的病理改变具有不均一性，患者实际病情进展无法通过常规诊断指标及时反映出来[11]。而LncRNA 表达检测便捷快速，患者接受度高，同时具备灵敏高效的特点。因此，开展LncRNA 在AML 发生与发展中的差异表达以及微核率在AML诊断中的价值研究，在临床中具有重要意义和应用价值。LncRNA 曾一度被认为是“基因噪音”，随着基因高通量测序技术的不断发展，大量研究渗透到表观遗传学领域。众多证据表明[12-13]，LncRNA 在血液系统肿瘤的发生与发展中具有重要作用，其介导的多种细胞过程在疾病的发展中起到调控功能[14]。

LncRNA作为重要的分子标志物[15]，其独特的表达信号与疾病的临床特征、突变及预后有关。研究表明[16]，LncRNA能够通过调控下游基因转录和表达参与机体正常造血，另一方面，LncRNA 也能使基因表观遗传沉默，或者使染色质重构，导致癌基因激活或抑癌基因失活[17]，造成恶性造血。Yang 等[18]的研究结果揭示了LncRNA 的促癌作用，他们提到的LINC00239促进了癌细胞增殖、集落形成和迁移能力，并且LINC00239 的存在一定程度上减少了阿霉素诱导的细胞凋亡，也就增加了AML 细胞对阿霉素的化学抗性。因此，LncRNA 在AML 的诊断和预后中有望成为一个新的分子标志物。Wang 等[19]报道，LINC00899 可用于AML的诊断和预后，成为一种新型血清生物分子标志物，他们对比了AML 患者组与对照组骨髓和血清中LINC00899 的表达水平，结果显示LINC00899 在患者组表达上调，同时与FAB分型和细胞遗传学有关。根据ROC曲线结果，LINC00899具备区分AML患者与正常人的能力。周晋宇等[20]也提出，LncRNA XLOC_109948在AML患者骨髓和血清中均呈现高表达，可判断AML 诊断、疗效及预后效果。然而关于LncRNA CUST_49525和CUST_47163在AML诊断中的价值研究目前在国内尚未见相关报道。

微核实验能够反映AML 患者淋巴细胞的遗传损伤[21]，近年来因其便捷快速，微核实验应用越来越广泛。本次研究采用胞质分裂阻滞法对比了AML患者与对照人群的血浆淋巴细胞微核率，结果显示AML患者微核率显著高于对照组。这说明AML患者的外周血淋巴细胞出现有丝分裂异常，从而引起染色体畸变，这种突变在AML 患者体内的发生率显著高于健康人群。因此，微核率可作为AML诊断的重要参考指标。本研究结果显示，LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 在AML患者血清中的表达较健康对照组明显下调。这表明，LncRNA CUST_49525和CUST_47163在AML中可能发挥着影响细胞增殖、迁移和侵袭的生理学功能，具有初步诊断AML 的作用。通过绘制AML 诊断价值的ROC 曲线，比较LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 以及微核率在AML 诊断中的截断值，考察其作为临床诊断指标的价值。ROC曲线分析结果提示，在诊断时检测LncRNA CUST_49525和CUST_47163的表达水平可提供有价值的结果信息。通过进一步分析发现，综合LncRNA CUST_49525和CUST_47163及微核率，做出联合诊断，其诊断价值高于单一指标，上述研究结果表明，AML诊断、治疗及预后过程中，使用微核率作为传统诊断指标的同时，将LncRNA CUST_49525和CUST_47163的相对表达纳入临床诊断的辅助指标，作出联合诊断，有助于AML 诊断分析的细化，并有助于临床决策。

目前对AML 中LncRNA 的调控机制和生物功能的研究，仍处于起步阶段，需要更多的临床试验和证据对其进行探讨。由于本研究采用的是横断面比较，并且纳入的临床病例较少，LncRNA CUST_49525 和CUST_47163 对患者生存率及预后的评估还需要进一步研究，其分子机制也需要体内和体外实验的结果来验证。