转化生长因子β诱导蛋白在胶质瘤中的表达及生物学功能

呙文静，邓 慧，宋 萍，张孟贤，*

(1.湖北文理学院附属医院/襄阳市中心医院肿瘤科，湖北 襄阳 441000；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科，湖北 武汉 430030)

弥漫性胶质瘤是成人最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，约占所有脑肿瘤的30%，脑恶性肿瘤的80%。弥漫性较低级别胶质瘤约占所有胶质瘤的15%，5 年生存率在30%～80%，预后差异较大。胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是成人最常见的恶性程度最高的胶质瘤，占所有中枢神经系统肿瘤的15%，尽管目前存在包括手术、放疗和替莫唑胺同步化疗[1]以及近来发展起来的免疫治疗、靶向治疗和肿瘤电场治疗等在内的多种标准治疗模式，其5 年生存率仍低于5%[2]。因此，寻找有效的治疗靶点和更加深入探讨胶质瘤的发病机制非常必要。

转化生长因子β 诱导蛋白(transforming growth factor β-induced protein，TGFBI)，是一种能结合整合素和细胞外基质蛋白的连接蛋白，在胚胎发育、细胞增殖、黏附、迁移、分化和炎症等过程中发挥着重要作用[3]。有研究表明TGFBI 在不同肿瘤中发挥不同的功能。TGFBI 在胃癌[4]、膀胱癌[5]和食管鳞癌[6]中异常过表达，提示其可能扮演促癌基因的角色；然而，在间皮瘤、乳腺癌和肺癌中，TGFBI 的表达水平明显降低[7-8]，因此它亦可能是一种抑癌基因。目前，关于TGFBI 在胶质瘤发生发展中作用的研究仍然很少，因此，本文旨在探讨TGFBI 在胶质瘤发生发展中的作用及潜在机制。

本研究利用癌症基因图谱(The Cancer Genome Altas，TCGA)、中国脑胶质瘤图谱(Chinese Glioma Genome Altas，CGGA)和脑肿瘤分子数据库(Rembrandt)分析TGFBI 在胶质瘤中的表达及其对患者预后的影响，并通过免疫组化实验对结果进行验证。此外，本研究还采用体外实验检测了TGFBI 对胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡和细胞周期的影响。然后采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)研究TGFBI 在肿瘤中可能参与并调控的通路，为后续确定TGFBI 在胶质瘤中的预后价值及明确其在胶质瘤发生发展中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM 培养液、胎牛血清(FBS)均购于美国Gibco公司；TGFBI 抗体购于美国Abcam 公司；二抗来自普诺森试剂盒；TRIzol 试剂购于上海普飞生物技术有限公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒、显色液均购于上海碧云天生物技术公司；CCK-8、PI均购于默克Sigma公司；Annexin Ⅴ-APC 凋亡检测试剂盒购于eBioscience公司；侵袭实验染色试剂盒购于美国Corning公司；内参基因和目的基因引物由吉凯基因设计和合成。

1.2 数据库和组织标本

从TCGA、CGGA 和Rembrandt 数据库下载胶质瘤患者的转录组数据和相应的临床信息，然后利用Graphpad Prism 8.0 软件整合分析并绘制TGFBI mRNA 在不同级别胶质瘤中的表达情况，分析TGFBI mRNA 与患者生存时间的关系并绘制Kaplan-Meier 曲线。本研究使用的脑胶质瘤组织芯片购自上海吉凯生物有限公司，阵列编号GL805b，该芯片包含35 例胶质母细胞瘤和5例正常脑组织。

1.3 免疫组化

组织芯片采用二甲苯脱蜡2 次，每次15 min，梯度乙醇水化，在微波炉里高火加热柠檬酸钠缓冲溶液(pH=6.0)至沸腾后低火维持20 min，待组织切片自然冷却后PBS 洗一次，一抗4 ℃孵育过夜，TBS 洗2次，5 min/次，加二抗室温孵育60 min，TBS 洗4次，5 min/次。DAB 染色，苏木素复染30 s，中性树胶封片。晾干，观察结果，拍照。综合考虑染色强度评分和染色阳性率评分，两者相乘得到IHC 评分，用于评估TGFBI 的表达水平。染色强度评分：按颜色深浅分别赋予0(阴性)、1(弱)、2(中)、3 分(强)；染色阳性率评分：阳性率0 为0 分，>0～25%为1 分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。IHC 评分=染色强度评分×染色阳性率评分，分数越高代表TGFBI表达水平越高。

1.4 细胞培养

本实验所用的胶质母细胞瘤细胞系U87和U373均来自国家实验细胞资源共享平台。两种细胞系均用含10%胎牛血清的DMEM 培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，根据细胞的生长情况分别进行换液或传代。

1.5 慢病毒载体的构建和转染目的细胞

从上海吉凯生物有限公司购买已设计好的针对TGFBI 序列的shRNA 慢病毒和相应的空载序列慢病毒，并转染U87 和U373 细胞，转染完毕后在37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养，嘌呤霉素筛选后用Western blot法验证转染是否成功。

1.6 CCK-8法检测胶质瘤细胞增殖

取对数生长期的细胞胰酶消化后制成细胞悬液，分为实验组和对照组：实验组细胞为带有针对TGFBI序列的shRNA的慢病毒，而对照组则为带有转染了相应的空载序列的慢病毒。随后将其接种于96 孔板中，每孔培养基总量100 μL，每组设5个复孔。将接种细胞的培养板放入培养箱中，37 ℃、CO2体积分数为5%条件下，根据实验需要，分别孵育24、48、72、96 和120 h。在每个时间点结束前，向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，孵育结束后，用酶标仪测定其在450 nm波长处的吸光度值D(450)。

1.7 Transwell细胞侵袭试验

分别将实验组和对照组的U87和U373细胞置于侵袭小室上层，含有10%胎牛血清的DMEM培养液置于侵袭小室的下层，在37 ℃培养箱孵育48 h 后，用棉签将小室上层细胞刮下去除，然后用4%多聚甲醛将小室下层细胞固定20 min，结晶紫染色后在显微镜下观察，每个上室随机取5 个100 倍视野拍照并进行细胞计数。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡情况

收集实验组和对照组的U87和U373细胞，用PBS洗涤2次后加入200 μL的结合缓冲液，加入10 μL的Annexin Ⅴ-APC 吹打混匀，室温避光孵育30 min，上机检测细胞凋亡情况。

1.9 流式细胞术进行细胞周期的检测

将实验组和对照组的U87和U373细胞分别用胰酶消化后制成细胞悬液，吸1 mL 细胞悬液离心后加入1 mL 70%的预冷乙醇，4 ℃固定过夜，PBS洗去乙醇后加入0.3 mL的PI，4 ℃避光孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.10 基因集富集分析

从TCGA 数据库下载胶质瘤患者的mRNA 数据，按照TGFBI mRNA表达水平中位数分为TGFBI高表达组和低表达组并制做成表型数据文件(cls 格式)，同时将mRNA 数据制作成与表型数据相对应的基因表达谱文件(gct 格式，矩阵形式)。然后，使用GSEA(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)网站提供的基于IAVA环境的GSEA软件(version 3.0)分析比较TGFBI高低表达组之间可能存在的差异表达基因及信号通路。在GSEA 分析中使用GSEA 官方提供的Molecular Signature Database(MsigDB)作为通路注释源，通过1 000次循环的排列组合寻找显著富集的信号通路。

1.11 统计学分析

本研究采用Graphpad Prism 6 进行数据统计和制图，应用SPSS 18.0 软件对实验数据进行统计学处理，二独立样本t检验进行数据分析，Kaplan-Meier生存分析绘制生存曲线，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基于数据库分析TGFBI mRNA 的表达及其与临床病理指标的相关性

从TCGA、CGGA和Rembrandt数据库下载GBM和转录组数据和相应的临床信息进行分析。如图1 所示，TGFBI mRNA 的表达水平与世界卫生组织(World Health Organization，WHO)定义的胶质瘤分级相关，随着肿瘤级别和恶性程度的增加，TGFBI mRNA 的表达水平也逐渐增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier 生存分析显示TGFBI mRNA 的表达水平与患者的预后呈负相关(P<0.05，见图2)。然后，本研究通过免疫组化检测TGFBI 蛋白在肿瘤组织和正常脑组织中的表达水平，结果显示，TGFBI 蛋白主要位于细胞质中，阳性表达呈棕黄色和棕褐色的颗粒(见图3)，35 例胶质母细胞瘤组织的免疫组化染色评分为5.96±4.01，高于对照组的评分0(P<0.05)。

图1 TGFBI mRNA在胶质瘤中的表达水平

图2 TGFBI mRNA不同表达水平胶质瘤患者的生存分析

2.2 TGFBI对胶质瘤细胞增殖的影响

采用慢病毒转染干扰TGFBI 的表达，构建TGFBI低表达的U87 和U373 细胞系，Western blot 检测结果显示，相较于阴性对照组，实验组sh-TGFBI中TGFBI蛋白的表达水平显著下降，说明转染成功(图4A)。应用CCK-8 试剂盒分别对对照组和sh-TGFBI 组胶质瘤细胞在24、48、72、96和120 h时间点进行细胞增殖能力的检测。结果显示，sh-TGFBI 组U87 和U373 细胞增殖能力较对照组明显降低(P<0.05，图4B)。表明敲低TGFBI基因表达后可抑制肿瘤细胞的增殖。

图4 TGFBI蛋白低表达可抑制胶质瘤细胞增殖

2.3 TGFBI对胶质瘤细胞侵袭的影响

Transwell实验结果(图5)显示，不同光镜视野中实验组两株胶质母细胞瘤细胞的数目明显少于对照组(P<0.05)，表明敲低TGFBI 的表达能显著抑制U87 和U373胶质瘤细胞的侵袭能力。

图5 敲低TGFBI后对U87和U373胶质瘤细胞侵袭的影响

2.4 TGFBI对胶质瘤细胞凋亡和细胞周期的影响

流式细胞术检测胶质瘤细胞凋亡和细胞周期分布情况(图6)，结果显示，转染了sh-TGFBI慢病毒颗粒的U87 和U373 细胞凋亡率分别为(7.92±0.57)%、(6.89±0.56)%，而阴性对照组细胞凋亡率分别为(3.94±0.23)%、(4.45±0.44)%。以上数据表明与对照组相比，实验组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。另外，本研究发现，与对照组比较，转染了sh-TGFBI 慢病毒颗粒的U87和U373细胞处于S期的细胞数减少，G2/M期细胞数增多(均为P<0.05)，而处于G1期的细胞无显著变化。

图6 U87和U373细胞敲低TGFBI对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的影响

2.5 TGFBI的功能基因集富集分析

为了进一步研究TGFBI 参与肿瘤的调控机制，利用TCGA 数据库，通过GSEA 方法分析了TGFBI 的表达所参与的信号通路，结果显示，TGFBI 高表达可能通过TOLL 样受体信号通路、NOD 样受体信号通路和JAK-STAT信号通路参与胶质瘤的发生发展(图7)。

3 讨论

人脑胶质瘤是高度恶性的颅内肿瘤，它表现为对正常脑组织的破坏，对常规治疗的抵抗以及广泛侵袭整个大脑[9]。世界卫生组织根据胶质瘤的组织病理学特征将其分为四级(I～IV)。尽管有最佳的治疗模式，胶质母细胞瘤(IV 级)患者的中位生存期仍只有15～18个月[10]。在本文中，我们讨论了在胶质母细胞瘤中的一个潜在的分子标志物，可能为胶质母细胞瘤的研究带来新的机遇。

研究证实TGF-β信号在癌前状态下发挥肿瘤抑制因子的作用，而在晚期癌症中则作为肿瘤促进剂发挥作用[11]。TGFBI，作为TGF-β信号通路的下游分子，有文献报道其在肿瘤进程中发挥促进和抑制的双重作用[12-13]。近年来，多项研究表明TGFBI 在不同类型肿瘤中的作用，如在卵巢癌[14]、食管鳞状细胞癌[6]、肾细胞癌[15]、黑色素瘤[16]、结肠癌[17]和肺腺癌[18]中发挥促肿瘤作用，而在白血病[19]、间皮瘤、乳腺癌[8]和肺癌[7]中起抑癌作用，因此，TGFBI 可能是一个广谱的生物标志物和治疗靶点。然而，TGFBI 在胶质瘤中的表达模式和确切作用尚不清楚。

A：JAK-STAT信号通路；B：NOD样受体信号通路；C：TOLL样受体信号通路.

在本研究中，我们用生物信息学方法证实了TGFBI 的表达水平与胶质瘤的恶性程度分级存在显著相关性，胶质瘤分级越高，其表达越丰富。并且TGFBI 高表达与胶质瘤患者的不良预后相关。随后免疫组织化学染色结果显示TGFBI 在胶质母细胞瘤组织中的表达水平显著高于正常脑组织。基于上述结果我们推测TGFBI 在胶质瘤的发生发展中可能扮演了癌基因的角色，为了进一步了解TGFBI 在胶质瘤中的生物学功能，我们通过CCK-8、Transwell 小室实验、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡和细胞周期的变化。结果显示，敲低TGFBI基因表达后，胶质瘤细胞U87 和U373的增殖速度减慢，侵袭能力下降，细胞凋亡率升高，并促使细胞滞留于G2/M 期。这些结果均提示TGFBI 在胶质瘤中可能作为一个促癌因子存在。Guo等[20]的实验通过pSUPER-shTGFBI 质粒转染U87 和U251细胞，发现TGFBI表达增强可以促进胶质瘤细胞增殖和迁移，此与我们的实验结果一致。Zhu 等[21]通过体外实验初步证实了胶质母细胞瘤TGFBI主要由M2型肿瘤相关巨噬细胞分泌，并作用于胶质瘤干细胞，促进干细胞特性而发挥作用。这些结果进一步显示TGFBI可能作为胶质瘤的潜在治疗靶点。

为了进一步探索TGFBI在GBM恶性进展中可能存在的分子机制，我们采用了GSEA 富集分析，结果显示TGFBI 在人胶质瘤中的作用机制可能与Toll 样受体(Toll-like receptors，TLRs)信号通路、NOD 样受体(Nod-like receptors，NLRs)信号通路和JAK-STAT信号通路密切相关。TLRs是一类重要的模式识别受体，参与人类自身免疫性疾病和恶性肿瘤的发生发展[22-23]。有研究发现TLRs 和相关的信号通路能够介导胶质瘤和其微环境中浸润的巨噬细胞之间的相互作用，联合激活巨噬细胞中TLR3/9可以更有效的抑制胶质瘤的恶性进展[24]。故而我们推测TGFBI可能由M2型巨噬细胞自分泌后与自身TLRs 结合从而调控胶质瘤的恶性生物学行为。NLRs同样是一种胞内模式识别受体，在介导免疫和肿瘤发生发展过程中具有重要作用[25]。已有研究报道NLRs参与胶质瘤血管生成[26]并且Nod样受体家族的分子NLRP3可通过白介素-1β和NF-κB通路促进胶质瘤的增殖和侵袭[27]，提示TGFBI 可能通过与NLRs相互作用参与胶质瘤的恶性进展。TLRs和NLRs均是启动固有免疫应答的关键分子，因此我们推测TGFBI 可能通过影响胶质瘤的免疫微环境或者系统或局部的免疫反应参与调控肿瘤的恶性生物学行为，具体作用机制需要进一步通过实验验证。JAK-STAT 信号通路在个体发育、细胞分化和维持体内稳态方面至关重要，该通路的失调通常与人类恶性肿瘤相关[28]。近来有研究发现JAK-STAT 通路参与免疫调节过程，包括对肿瘤细胞的识别和介导肿瘤细胞的免疫逃逸。Henrik 等[29]发现抑制胶质母细胞瘤反应性星形胶质细胞中JAK-STAT 通路后可以将促炎/抗炎的平衡转向促炎环境，提示TGFBI 可能通过该通路影响微环境而对胶质瘤的生物学行为进行调控，这些结果为后续研究TGFBI如何影响胶质瘤恶性进展提供了方向。

综上所述，我们的研究强调了TGFBI 表达水平的升高与高的肿瘤分级和较差的肿瘤预后有关，同时体外实验证实了TGFBI 的高表达能够促进胶质瘤细胞恶性增殖，增强其侵袭性，抑制凋亡和改变细胞周期的作用。然而TGFBI 对促进胶质瘤恶性进展的机制尚需进一步探索，此外，对于TGFBI 的促癌作用尚需在人脑的其他细胞系、胶质瘤原代细胞和体内动物实验中获得更多的实验证据加以证实。