miR-122-5p靶向KDM2A对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响*

徐捷 彭昊 万龙彪 刘丰

骨质疏松症是一种常见的代谢性骨病，其临床特征主要是骨量减少和骨微观结构的破坏。研究发现，骨质疏松患者发生骨折的概率较健康人群显著增加，严重危害患病人群的生活质量[1-2]。现有研究普遍认为，骨质疏松的主要原因是骨吸收和骨形成之间的平衡被打破，导致骨量减少。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）是一类来源于中胚层的干细胞，具有多向分化的能力[3]。研究表明，BMSC成骨分化能力减弱是骨质疏松的重要发病机制[4]。因此，促进BMSC成骨分化以纠正骨代谢平衡是治疗骨质疏松症的潜在方式之一。

microRNA（miRNA）属于小RNA家族，长度为18 ～ 25个核苷酸。miRNA能够特异性结合下游靶基因，抑制其蛋白翻译，进而调控细胞增殖、分化和凋亡等生理和病理过程[5]。研究表明，miRNA在骨代谢平衡中也发挥重要作用。目前，已发现多种miRNA能够通过促进或抑制BMSC成骨分化进而影响骨量的形成[6]。以往研究表明，miR-122-5p广泛参与各项生理病理过程，如Circ_LRP6和HMGB1竞争性结合miR-122-5p参与调控骨肉瘤的进展[7]，miR-122-5p通过介导TGF-β1和ATG5之间的负反馈回路参与调控细胞纤维化[8]。除此之外，研究表明，miR-122-5p是骨质疏松症的潜在诊断生物标志物，骨质疏松症患者血清中miR-122-5p表达水平显著降低[9]。然而，miR-122-5p在骨质疏松发病机制中的调控作用尚不清楚，尤其是对BMSC成骨分化的影响尚未见报道。此外，研究表明组蛋白去甲基化酶2A（histone demethylation protein 2A,KDM2A）在多种疾病中发挥重要的调控作用。Deng等[10]的研究发现，KDM2A通过上调SOX2和NANOG表达促进牙源性干细胞向成脂方向分化，进而影响牙源性干细胞成骨/成脂分化平衡。但KDM2A对人BMSC成骨分化的影响却鲜有报道。因此，本实验以BMSC为研究对象，探讨miR-122-5p对KDM2A的调控作用，以及两者对BMSC成骨分化的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞

人骨髓间充质干细胞购于西安捷晶生物技术有限责任公司。

1.2 主要试剂

MEM基础培养基（12571063）、胎牛血清（12483020）和胰蛋白酶（25200056）均购于美国Gibco公司。成骨分化培养基（HUXMX-90021）购于中国赛业生物科技公司。miR-122-5p mimic，miR-122-5p inhibitor，miR-NC，过表达KDM2A质粒（OE-KDM2A）和空白对照（OE-NC）由中国广州锐博生物技术有限公司合成。茜素红染色试剂盒（C0138），BCⅠP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（C3206）和双萤光素酶检测试剂盒（RG088S）均购自中国碧云天公司。OPN（25715-1-AP）、RUNX2（82636-2-RR）、ALP（11187-1-AP）、KDM2A（24311-1-AP）和GAPDH（10494-1-AP）兔多克隆抗体以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔ⅠgG二抗（SA00001-2）购于武汉三鹰生物科技有限公司。

1.3 细胞培养和转染

人BMSC培养于含10%胎牛血清的MEM培养基中，细胞在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。当细胞密度达到80% ～ 90%时，PBS冲洗细胞3次，每次2 min，1 mL胰蛋白酶消化细胞1 ～ 2 min，随后用2 mL MEM培养基终止消化，将细胞悬液于15 mL离心管中离心，最后将细胞分别接种于6孔板中，当BMSC融合率达到80% ～ 90%时，利用Lipofectamine 2000试剂转染细胞，分组为：miR-NC组、miR-122-5p mimic组、OE-NC组、OE-KDM2A组和OE-KDM2A+ miR-122-5p mimic组。

1.4 qRT-PCR检测miR-122-5p和成骨基因表达情况

利用Trizol裂解细胞，加入氯仿抽提RNA，最后加入异丙醇沉淀RNA，离心后用75%乙醇洗涤RNA，晾干后利用酶标仪测定RNA浓度。利用Takara反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，将提取的RNA与各种试剂混匀后进行反转录，反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s。利用Takara扩增试剂盒检测miR-122-5p以及成骨相关基因（OPN、ALP和RUNX2）的表达情况，将cDNA与Takara试剂盒中的试剂按照相应配比混匀，反应条件为：98℃ 10 s，55℃ 5 s，71℃ 1 min，30 ～ 50 cycles。其中U6和GAPDH分别为miR-122-5p和成骨基因的内参。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot检测蛋白表达水平

利用RⅠPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白（电泳条件：80 V 30 min，120 V 60 min），随后将蛋白转移至PVDF膜上（转膜条件：400 Ma 40 min），5%脱脂牛奶封闭后，4℃条件下过夜孵育一抗，TBST清洗PVDF膜，室温条件下孵育二抗1 h，最后使用ECL发光液曝光显影条带。

1.6 茜素红染色检测钙沉积情况

将转染后的BMSC在MEM培养基条件下培养2 d，随后将MEM培养基更换为成骨诱导培养基，培养期间每2天换液1次，2周后使用4%多聚甲醛固定20 min，茜素红染色30 min，去离子水清洗去除多余染液后，于显微镜下拍照观察。使用十二烷基硫酸钠溶解钙结节，检测405 nm处的吸光度用于定量分析钙沉积情况。

1.7 碱性磷酸酶染色检测酶活性

将转染后的BMSC在MEM培养基条件下培养2 d，随后将MEM培养基更换为成骨诱导培养基，培养期间每2天换液1次，1周后使用4%多聚甲醛固定20 min，使用BCⅠP/NBT碱性磷酸酶显色试剂染色20 min，PBS清洗去除多余染液后于显微镜下拍照观察。使用碱性磷酸酶检测试剂盒测定410 nm处吸光度用于定量分析碱性磷酸酶活性。

1.8 双荧光素酶报告试验

使用TargetScan在线数据库预测KDM2A和miR-122-5p相互结合位点，分别构建野生型（WT）和突变型（MUT）3'-UTR荧光素酶表达质粒，将BMSC按照1.3中的方法接种于6孔板中，待BMSC融合率达到80% ～ 90%时，将上述质粒分别与miR-122-5p mimic和miR-122-5p NC共同转染至BMSC中，48 h后测定荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，三组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-122-5p影响BMSC成骨分化

首先，使用qRT-PCR方法检测miR-122-5p在BMSC成骨诱导分化前后的表达情况，结果显示miR-122-5p的表达水平在BMSC成骨诱导后显著上调（P＜0.05，见图1A），提示miR-122-5p可能参与调控BMSC成骨分化。随后，使用miR-122-5p mimic进一步探讨miR-122-5p在BMSC成骨分化中的作用。qRT-PCR和Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-122-5p mimic显著上调成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表达水平（P＜0.05，见图1B、C）。茜素红染色及定量分析显示，与miR-NC组相比，miR-122-5p mimic组BMSC细胞钙沉积水平显著升高，（P＜0.05，见图1D、E）。碱性磷酸酶染色及定量分析显示，miR-122-5p mimic组BMSC细胞钙沉积水平显著高于miR-NC组（P＜0.05，见图1F、G）。

图1 miR-122-5p影响BMSC成骨分化：A. qRT-PCR方法检测miR-122-5p在BMSC成骨诱导分化前后的表达情况；B. qRT-PCR检测miR-122-5p mimic对BMSC成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表达水平；C. western blot检测miR-122-5p mimic对BMSC成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表达水平；D. 茜素红染色检测miR-122-5p mimic对BMSC钙沉积的影响；E. 钙沉积的定量分析；F. 碱性磷酸酶染色检测miR-122-5p mimic对BMSC碱性磷酸酶活性的影响；G. 碱性磷酸酶活性的定量分析

2.2 miR-122-5p靶向调控KDM2A

Targetscan在线数据库显示miR-122-5p和KDM2A之间存在特异性结合位点（见图2A）。双荧光素酶报告基因显示，miR-122-5p mimic+KDM2A-WT组的萤光素酶相对活性显著低于miR-122-5p NC+KDM2A-WT组，而miR-122-5p mimic+KDM2A-MUT和miR-122-5p NC+KDM2A-MUT两组的萤光素酶相对活性无显著变化（见图2B），提示miR-122-5p和KDM2A能够靶向结合。Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-122-5p mimic能够抑制KDM2A蛋白表达水平，而miR-122-5p inhibitor能够上调KDM2A蛋白表达水平（见图2C）。

图2 miR-122-5p靶向调控KDM2A：A. Targetscan在线数据库预测miR-122-5p和KDM2A特异性结合位点；B. 双荧光素酶报告实验检测miR-122-5p和KDM2A相互结合关系；C. Western blot实验检测miR-122-5p对KDM2A蛋白表达水平的影响

2.3 KDM2A影响BMSC成骨分化

qRT-PCR和Western blot结果显示，与si-NC组相比，si-KDM2A显著上调成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表达水平（P＜0.05，见图3A、B）。茜素红染色及定量分析显示，与si-NC组相比，si-KDM2A组BMSC细胞钙沉积水平显著升高（P＜0.05，见图3C、D）。碱性磷酸酶染色及定量分析显示，si-KDM2A组BMSC细胞钙沉积水平显著高于si-NC组（P＜0.05，见图3E、F）。

图3 KDM2A影响BMSC成骨分化：A. qRT-PCR检测si-KDM2A对BMSC成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表达水平；B. Western blot检测si-KDM2A对BMSC成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表达水平；C. 茜素红染色检测si-KDM2A对BMSC钙沉积的影响；D. 钙沉积的定量分析；E. 碱性磷酸酶染色检测si-KDM2A对BMSC碱性磷酸酶活性的影响；F. 碱性磷酸酶活性的定量分析

2.4 miR-122-5p靶向KDM2A影响BMSC成骨分化

qRT-PCR和Western blot结果显示，与miR-NC组相比，miR-122-5p mimic显著下调成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因和蛋白水平上的表达水平，而OEKDM2A能够逆转miR-122-5p mimic对成骨相关基因的抑制作用（P＜0.05，见图4A、B）。茜素红染色及碱性磷酸镁染色分析显示，与miR-NC组相比，miR-122-5p mimic显著抑制BMSC细胞中钙沉积情况和碱性磷酸酶活性，而OE-KDM2A能够逆转miR-122-5p mimic的抑制作用（P＜0.05，见图4C-F）。

图4 miR-122-5p靶向KDM2A影响BMSC成骨分化：A. qRT-PCR检测OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共转染对BMSC成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表达水平；B. Western blot检测OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共转染对BMSC成骨相关指标（OPN、ALP和RUNX2）在基因水平上的表达水平；C. 茜素红染色检测OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共转染对BMSC钙沉积的影响；D. 钙沉积的定量分析；E. 碱性磷酸酶染色检测OE-KDM2A和miR-122-5p mimic共转染对BMSC碱性磷酸酶活性的影响；F. 碱性磷酸酶活性的定量分析

3 讨论

人体骨骼系统始终处于骨形成和骨吸收的动态平衡之中。当这种骨代谢的平衡关系被打破后，就会导致骨量丢失、骨稳定性下降和骨脆性的风险增加，最终导致骨质疏松症[11]。成骨细胞是主要由间充质干细胞分化而来的骨形成细胞。成骨细胞可以特异性分泌骨基质，在骨形成和重建中发挥关键的调节作用[12]。在骨质疏松症中，BMSC成骨分化能力减弱会加重骨质疏松症的进展，而恢复BMSC成骨分化能力则能够延缓疾病进展。例如，芝麻脂素能够通过直接促进BMSC成骨分化来延缓骨质疏松的进展[13]。除了药物治疗，从基因水平调控干细胞成骨分化能力也是一种具有发展前景的治疗方式。越来越多的研究表明，miRNA通过转录后调控基因表达情况，进而参与调控多种病理生理过程。随着研究的深入，人们发现miRNA在调控骨质疏松进展中发挥着重要作用。例如，Li等[14]发现过表达miR-149-3p能够促进干细胞成骨分化，是骨质疏松症潜在的治疗靶点。Yin等[15]揭示miR-215-5p通过靶向XⅠAP调节干细胞成骨分化和骨质疏松症的进展。以上结果提示，miRNA能够通过调控干细胞成骨分化缓解骨质疏松症的进展。

miR-122-5p已被发现广泛参与调控各种疾病，包括腹膜纤维化、肺损伤以及肿瘤的发生与发展。例如，miR-122-5p通过靶向Smad5激活Wnt/β-连环蛋白途径促进腹膜纤维化[16]。miR-122-5p通过靶向ⅠL1RN减轻脂多糖诱导的急性肺损伤[17]。在骨科领域，miR-122-5p已被证实与骨肉瘤细胞的迁移和增殖相关。值得注意的是，对于miR-122-5p在骨质疏松症中的研究仅有少量报道，且以往的研究仅发现miR-122-5p在骨质疏松症患者血清中的表达水平显著降低，是骨质疏松症的潜在诊断生物标志物[9]。然而，miR-122-5p在骨质疏松发病机制中的调控机制尚不清楚，尤其是对BMSC成骨分化的影响尚未见报道。在此基础之上，本研究着重探讨miR-122-5p对BMSC成骨分化的影响。通过体外实验发现，miR-122-5p能够促进BMSC成骨基因的表达、钙沉积及碱性磷酸酶的活性，提示miR-122-5p参与调控BMSC成骨分化。

研究表明，miRNA通过靶向下游靶基因的翻译参与介导各种疾病的发展[18]。组蛋白去甲基化酶2A（KDM2A）已被证实参与调控干细胞成骨分化[19]。据此推测，miR-122-5p可能通过靶向调控下游KDM2A进而参与调控BMSC成骨分化。首先，笔者利用双荧光素酶报告试验证实两者之间存在相互结合关系；随后，利用小干扰RNA证实沉默KDM2A能够促进BMSC成骨分化；最后，通过功能回复实验发现沉默KDM2A能够促进BMSC成骨分化，而miR-122-5p inhibitor能够逆转si-KDM2A的促进作用。以上结果提示，miR-122-5p靶向KDM2A影响BMSC成骨分化。

值得说明的是，尽管本研究发现miR-122-5p能够靶向KDM2A影响BMSC成骨分化，但对于KDM2A如何调控BMSC成骨分化的机制仍不清楚。KDM2A属于组蛋白去甲基化酶的一种，后者已被发现参与调控组蛋白的甲基化，而甲基化能够改变DNA的折叠和暴露状态，进而影响干细胞的分化[10]。提示KDM2A可能通过参与调控组蛋白甲基化而影响BMSC成骨分化。除了miR-122-5p能够靶向KDM2A影响BMSC成骨分化，关于miR-122-5p和KDM2A在骨质疏松中的诊断和治疗价值仍有待进一步研究。以往研究表明，miRNA可以作为独立诊断标志物，但由于本研究缺少人体组织样本，miR-122-5p能否作为骨质疏松的诊断和预后标志物仍需进一步临床研究。此外，由于KDM2A可能通过参与调控组蛋白甲基化进而影响BMSC成骨分化，提示KDM2A有望为骨质疏松的分子治疗提供新的研究方向。需要注意的是，本研究使用的人源的BMSC，由于人和动物之间存在种属差异，因此本研究仅从细胞水平探索了miR-122-5p和KDM2A在BMSC成骨分化中的作用，关于miR-122-5p和KDM2A在动物实验中的效果以及在临床中的使用价值仍有待进一步深入研究。

综上所述，miR-122-5p靶向抑制KDM2A表达进而促进BMSC成骨分化。但BMSC成骨分化机制复杂，仍有待进一步研究。