嵌合抗原受体T细胞治疗结肠癌的研究进展

龙赤荣 张 露 彭 上 闵静婷 李正红

蚌埠医学院1.基础医学院；2.生命科学学院，安徽 蚌埠 233030

结肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常见的恶性肿瘤之一，是世界上第三大发病和第二大致命的癌症[1］。化疗、放疗或手术是大多数癌症患者的治疗选择[2］，然而，传统疗法没有表现出很好的治疗效果。嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）疗法是目前有效的血液恶性肿瘤治疗方式之一[3-5］，其在血液系统恶性肿瘤中的疗效已经得到证实。然而，对于包括CRC在内的实体肿瘤，由于缺乏肿瘤特异性抗原、靶向非肿瘤效应、CAR-T对肿瘤的浸润水平较低和免疫抑制肿瘤微环境的存在等因素，难以达到如同血液瘤那样的治疗效果。因此，了解近年来CAR-T疗法在结肠癌方面的研究是非常重要的，为未来应对结肠癌治疗提供参考。

1 CAR-T细胞疗法

1.1 CAR-T细胞疗法的概述

Gross 等[6］最早提出嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）的概念。CAR 包括1 个赋予抗原特异性的靶结合细胞外区域，包括单链抗体（single-chain Fv，ScFv）片段、铰链区和跨膜区，以及1 个主要通过CD3ζ 信号链介导T 细胞激活的细胞内区域[7-8］。

目前，CAR 的发展可分为4 代。已经使用的初级刺激信号链，例如Fc受体γ链（Fc receptor gamma chain，FcεRIγ 链）、CD3 分子ζ 链（zeta chain of the CD3 molecule，CD3ζ）、DNAX 相关蛋白10（DNAXassociated protein 10，DAP10）、ζ 链 相 关 蛋 白-70（zata chain associated protein-70，ZAP70）、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte specific protein tyrosine kinase，LCK）和Src 家族酪氨酸激酶（src family tyrosine kinases，FYN），它们是第1 代CAR[9］。第2 代在胞内区域有1 个共刺激域，如CD28 分子、CD137 分子等。这些结构域加强了CAR-T 细胞在体内的增殖、细胞毒性、持续反应和持久性。在第3代中，CAR受体包含2个共刺激域，以增加细胞因子的产生和抗肿瘤作用[10］。在第4代中，将CAR 与细胞因子白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）等结合在一起[11］。这一代能够增加T 细胞的活化，招募和激活肿瘤的内源性固有免疫细胞，改变肿瘤微环境并增加T 细胞持久性[12］。

1.2 CAR-T细胞疗法的作用机制及优势

当单链抗体与抗原结合时，CAR-T细胞通过细胞内结构域启动细胞破坏机制。CAR-T 细胞通过3条主要途径使肿瘤细胞发生死亡[13］：（1）快速反应释放穿孔素和颗粒酶，是肿瘤细胞死亡的主要机制[14］。当激活的CAR-T细胞在肿瘤细胞的刺激下，会释放出含有穿孔素的细胞毒性颗粒，这些颗粒能够溶解肿瘤细胞并使肿瘤细胞发生死亡；（2）动作缓慢的Fas-FasL 途径，FasL 在CAR-T 细胞高表达，而Fas 在肿瘤细胞表达，FasL 与Fas 相互识别后，活化了它们之间连接的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶级联反应，使肿瘤细胞发生程序性细胞死亡；（3）细胞因子，活化的CAR-T产生的细胞因子能够抑制肿瘤细胞生长，调节肿瘤微环境，起到抗肿瘤的作用。由于先天免疫的激活，这些细胞因子的激活将触发CAR-T细胞杀伤肿瘤[15］。

CAR-T 细胞是在T 细胞的基础上改造而成的，T 细胞是人体内消灭肿瘤细胞的主力军。具体而言，从患者自己的血液或健康提供者的血液中获取的T细胞，通过基因工程技术，使T细胞表达肿瘤特异性识别的CAR，将抗原抗体结合机制和T 细胞的杀伤作用结合，从而让患者具有抗肿瘤的能力[16］。CAR-T 细胞疗法在抗肿瘤活性方面显示出强大的优势。作为一种以主要组织相容性复合体抑制的方式引导T 细胞特异性的方法，它最近被应用于增强免疫系统在自然反应失败时对肿瘤细胞的反应[17］。CAR-T表达工程受体和嵌合结构，以主要组织相容性复合体独立的方式识别癌抗原，并能对其产生特异性反应[18］。

1.3 CAR-T疗法的局限性

使用CAR-T 细胞也存在一些局限性。（1）细胞因子释放综合征。在接受CD19 CAR-T细胞治疗的患者中，在输注后的第1 周，发生了细胞因子释放综合征[19］。这种效应是CAR-T 细胞在受到刺激后引起过度激活的免疫反应的结果，它与给药剂量无关，而是与治疗反应和肿瘤负担相关[20］。（2）神经毒性。脑病患者在输注CD19 CAR-T 细胞治疗后的5 ～ 7 d，可能会出现定向障碍、局部神经功能缺损和癫痫发作[21］。但神经毒性仅在靶向CD19 和CD20的CAR-T细胞治疗中被报道，到目前为止，没有证据表明其在实体肿瘤治疗中产生神经毒性。（3）靶向非肿瘤效应。这是指CAR-T细胞可以被表达靶向抗原的正常组织激活，从而破坏非肿瘤细胞。如CD19在B 细胞中广泛表达[22］，使用CD19靶向CAR-T细胞不仅会破坏CD19+的肿瘤细胞，还会破坏正常的B 细胞，从而导致B 细胞再生障碍[23］。（4）CAR-T细胞的质量和数量。生产CAR-T细胞需要大量T 细胞的供应。不幸的是，CAR-T 细胞目前仅被批准用于血液恶性肿瘤，而一些患者缺乏足够数量的T 细胞来制造CAR-T。此外，许多患者之前接受过化疗，导致CAR-T 细胞的数量和质量较低[24］。

2 CAR-T治疗CRC的靶点

CAR-T 细胞治疗癌症的一个关键问题是识别特定于每种癌症类型的靶抗原。在肿瘤细胞中，肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）过度表达，这些TAA很容易识别，并且被许多患者共享，但是使用CAR-T细胞靶向TAA，可能会由于其低特异性而产生副作用。对于TAA，CAR-T细胞治疗CRC常见的靶点有癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）、人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）、肿瘤相关糖蛋白-72（tumor-associated glycoprotein-72，TAG-72）和鸟苷酸环化酶C（guanylate cyclase C，GUCY2C）。

CEA在98.8%的CRC组织中过表达，它不仅可以作为肿瘤诊断和预后的标志物，同时也是一种有希望的CRC治疗的新靶点[25］。

HER-2 常与人表皮生长因子受体-3（human epidermal growth factor receptor-3，HER-3）组成异源二聚体，通过与配体结合被激活[26］。研究表明，HER-2 过表达约占所有CRC 的2%，其过表达通常由基因扩增引起，HER-2可能成为CRC靶向治疗的潜在预测生物标志物[27］。

TAG-72在大多数正常组织中不表达，与正常黏膜相比，80%的CRC中TAG-72过表达，CRC患者血清中发现TAG-72 表达升高[28］。关于靶向TAG-72的CAR-T细胞治疗CRC的研究中结果证明了CART细胞的相对安全性[29］。

GUCY2C 属于黏膜环化酶受体家族，GUCY2C在近95%的CRC中过度表达，该受体催化三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）转化为环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），触 发cGMP 相关信号通路的激活，从而调节肠内稳态过程，如上皮细胞增殖、分化和凋亡[30］。信号轴的失调将会出现炎症性肠病和肠道运输障碍，并促进癌症的发展。在肿瘤发生的早期阶段，GUCY2C 结合配体的丢失，导致信号通路沉默并促进肠道转化[31］。

除了以上靶点，CAR-T细胞治疗CRC的靶点还有上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM）、造血干细胞抗原CD133和细胞间质上皮转换因子（cellular-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）等，这些靶点都有可能成为CAR-T治疗的选择。

3 CAR-T细胞疗法的应用

3.1 临床前研究

体外研究结果显示，靶向不同CRC 抗原的CAR-T 细胞的细胞毒性效应已被证明针对多种人类CRC 细胞系，包括LoVo、SW620、HT-29 和DLD-1等。Zhang 等[32］研究表明，针对特定类型的CAR-T细胞，每个细胞系表达不同的抗原与不同的抗原密度将影响抗肿瘤的效果。

Ang 等[33］于2017 年发表了在异种移植模型方面的第1项临床前研究，重点研究了EpCAM靶向的CAR-T细胞的细胞毒性效应。该研究表明，通过信使RNA（messenger RNA，mRNA）电穿孔产生的抗EpCAM CAR-T 细胞的多次重复输注延缓了携带CRC 异种移植物的免疫缺陷小鼠的疾病进展。此外，关于结肠癌患者来源的异种移植小鼠模型，已经被证明反映了患者的临床和分子异质性，并重建了肿瘤免疫抑制微环境[34］，并被用于抗CRC CAR-T细胞的2个临床前研究。其中1种在使用以间皮素（mesothelin，MSLN）为靶点的第3代CAR-T治疗后，表现出显著的抗肿瘤效果，并且在给药后至少10 d细胞持续存在[35］。另1 项研究表明，HER-2 CAR-T细胞能够在CRC 人来源肿瘤异种移植于免疫缺陷小鼠模型中诱导肿瘤消退甚至消除，并保护治疗动物免受肿瘤再次攻击[36］。

作为CAR-T 细胞治疗CRC 研究最多靶点之一的CEA，靶向CEA 的第2代CAR-T细胞在体外和体内均显示出良好的抗肿瘤效果，当与IL-12结合时，抗肿瘤效果增强[37］。

由于在临床前研究中获得了有希望的结果，许多CAR-T 细胞治疗CRC 已经在临床试验中进行了抗肿瘤疗效和安全性评估。

3.2 临床试验

在临床试验中，CAR-T疗法在癌症方面的应用逐渐增加，提供了许多临床证据。尤其是在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得良好的效果。美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）在2017年至2021年间批准上市的靶向CD19的CAR-T细胞疗法共有4 种[38-39］，分别是Kymriah、Yescarta、Tecartus 和Breyanzi，它们被用于治疗B 细胞急性淋巴细胞白血病或B细胞非霍奇金淋巴瘤。

关于CRC，一些针对各种肿瘤抗原的临床试验已被批准。在2014年，开始了第1个CRC的CAR-T临床试验（NCT02349724），研究第2 代CEA CAR-T细胞在CRC 患者中的安全性和有效性。在接受CAR-T细胞后，观察到10例先前接受治疗的进行性疾病患者中有7 例病情稳定，2 例病情持续超过30 周，并显示肿瘤缩小。此外，大多数患者的血清CEA 水平降低。关于安全性，发热被认为是与CAR-T 细胞输注相关的最重要事件。10 例接受治疗的患者中有2例在CAR-T细胞治疗后数小时内出现高热（39 ～ 40 ℃），并且在细胞注射后的1 ～ 4 d内再次出现高烧。同样类型的抗CEA CAR-T 细胞已经在CEA 阳性腺癌伴肝转移患者中进行了研究（NCT02416466 和NCT02850536 试验），通过肝动脉灌注来改善CAR-T 细胞向肝转移的转运。在NCT02416466 试验中，所有患者中观察到不同的症状，但是这些患者均未出现与CAR-T细胞治疗相关的严重不良事件[40］。在NCT02850536试验中，通过使用压力驱动的药物输送系统，该装置旨在克服肿瘤内压力，将CAR-T 细胞向肝转移的输送提高5.2倍，研究者报道了1名患者的治疗情况，显示总生存期增加和完全代谢反应，与之前的试验一样，CAR-T输注与任何严重不良事件无关[41］。

4 展 望

CAR-T 细胞免疫疗法是一种非常有前途的肿瘤治疗方法，特别是对B细胞等血液恶性肿瘤的治疗。CAR-T 细胞在治疗CRC 的临床研究中取得了较好的疗效，未来的CAR-T 细胞治疗的方向是研究个性化的CAR-T 细胞治疗产品。由于患者具有个体差异性，在使用CAR-T 细胞免疫疗法治疗肿瘤时，CAR-T细胞的剂量和输液方式以及合适的治疗方案是需要进一步探讨的问题。此外，通过改变和优化CAR-T 自身的结构，寻找合适的肿瘤特异性抗原等策略，可使CAR-T 细胞达到精准靶向杀伤肿瘤的目的。相信未来的CAR-T 细胞免疫疗法在治疗CRC 方面将迈出新的步伐，其在临床实践的应用将会达到更加高效和安全的水平，最终将会延长CRC 患者的生命和提高患者的生存质量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突