法舒地尔对大鼠脊髓损伤Rho/ROCK2激酶及铁死亡的影响

翟永喜,孙林林

1.郑州市第七人民医院骨科,郑州 450000; 2.郑州市第七人民医院神经外科,郑州 450000

交通事故、坠落、自然灾害常常导致身体多发损伤,而脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是临床常见的创伤性中枢神经疾病[1],具有较高的病死率及致残率,严重影响患者的生活质量,给家庭及社会经济带来沉重的负担[2]。目前SCI仍是骨科和神经外科治疗的热点和难点[3]。原发性SCI后常伴继发性损伤,发生神经细胞的病理生理改变(细胞自噬、凋亡、焦亡等),进一步引起神经组织的相关损伤,因此针对减轻SCI后神经损伤的保护性药物及相关机制的研究至关重要[4-5]。铁死亡是神经细胞死亡的重要方式,其主要特征是依赖铁的程序性死亡方式,产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),导致谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)减少,引起细胞损伤或死亡。既往研究[6-7]表明,铁死亡在SCI中存在形态学及分子细胞水平的证据,且抑制剂去铁胺干预铁死亡后修复了SCI,改善了大鼠的肢体功能。目前很多研究证实,抑制铁死亡具有神经保护作用,特别对创伤性神经损伤具有修复作用,然而影响铁死亡的关键蛋白尚处于探索阶段。

法舒地尔(fasudil hydrochloride,Fasudil)是异喹啉磺酰类药物,是一种血管扩张剂,通过抑制肌球蛋白轻链磷酸化,进一步作用于Rho/ROCK激酶发挥作用,主要影响细胞骨架分化迁移、平滑肌收缩等多种功能,参与细胞生长、发育、迁移和凋亡等生命活动[8]。ROCK1与ROCK2是Rho激酶(Rho亚家族蛋白A/相关卷曲螺旋形成蛋白激酶,ROCK)的亚型,互为同分异构体,ROCK2主要在神经系统中聚集[9]。而Fasudil以及Rho/ROCK2激酶对SCI大鼠铁死亡的研究国内外报道甚少。本研究通过撞击法制备大鼠SCI模型,给予法舒地尔进行治疗,观察SCI大鼠Rho/ROCK2激酶及铁死亡相关蛋白的变化,对SCI发生的分子机制进行研究,为SCI的临床救治提供新的理论基础。

材料与方法

1 材料

1.1实验动物 成年雄性SD大鼠,12周龄(体质量225.2～245.5g),购于郑州市华兴实验动物养殖场,于郑州市第七人民医院6号楼动物实验中心饲养,光照及黑暗各12h交替,动物房温度22℃,食水自由,操作轻柔减少不良反应及大鼠的痛苦。本研究所有动物的处理及操作通过郑州市第七人民医院医学伦理委员会审批(20191015)。

1.2主要试剂与仪器 Fasudil注射液 (天津红日药业,30mg;2mL,中国),铁检测试剂盒、活性氧( Reactive oxygen species,ROS)(碧云天生物有限公司,中国),Rho/ROCK2抗体(Wanleibio,中国),xCT及GPX4抗体(Abcam公司,英国)、PVDF膜(Millipore公司,美国),DAB显色试剂盒(中杉金桥,中国),冰箱(-20℃,-80℃,海尔公司,中国),电转仪、电泳仪(北京六一,中国)。微量转移器(Eppendorf公司,德国)。

2 方法

2.1动物分组与SCI模型制作[10]大鼠编码后按随机数字表法分Sham组(假手术组)、SCI组(脊髓损伤组)、Fasudil组(SCI+ Rho/ROCK2抑制剂Fasudil组),各12只。大鼠腹腔注射戊巴比妥(2%,50mg/kg)麻醉,麻醉成功后俯卧位于大鼠固定装置,皮肤消毒并切开,暴露T9～T11,咬骨钳咬除T9～T11棘突及椎板等骨性组织,显微剪刀剪开硬脊膜,显微镊子打开暴露颈髓。用脊髓损伤器准确撞击大鼠脊髓(高度6cm,重量10g),制备SCI模型,逐层缝合,消毒并包扎。保温复苏后继续饲养。造模成功标准:硬膜下大鼠躯体及双下肢痉挛性回缩,瘫痪状态。术后每天进行膀胱按摩2次促进排尿,直至排尿功能恢复。大鼠无死亡及伤口感染。

Sham组只咬除T9～T11棘突及椎板等骨性组织,不造成SCI。Fasudil组:造模成功后每日1次腹腔注射Fasudil(10mg/kg),治疗2周[11]。Sham组与SCI组给予同剂量生理盐水。

2.2Basso-Beattie-Bresnahan locomotor scale(BBB)评分 各组大鼠分别于第1、3、7、14、21、28天进行BBB评分。大鼠放置于盆中,轻敲使其爬行,观察并记录四肢运动及协调情况,BBB评分包括:后肢运动及活动度(0～7分),后肢的步态及前后肢体协调(8～13分),运动中足趾及尾巴精细动作(14～21分)。后肢全瘫无活动为0分,活动正常为21分。BBB评分结束后进行组织检测。

2.3Fe2+含量检测 麻醉大鼠,取各组大鼠脊髓组织,洗涤、匀浆、离心后取上清液待测,配制工作液,按顺序加入待测液,形成络合物,在波长520nm检测吸光值,计算并记录Fe2+含量。

2.4ROS含量检测 麻醉大鼠,取各组大鼠脊髓组织,酶解法分解,2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA) ROS荧光探针检测样品中ROS含量(详细步骤按ROS试剂盒说明书进行操作),激发波长为502nm,发射波长为530nm附近波峰最大,结果用平均荧光强度表示。

2.5免疫印迹法实验 麻醉大鼠,于损伤部位上下收集脊髓组织,存于-80℃,用时取出放置于EP管中剪碎,超声震碎,溶解于裂解液中,离心取上清液,测定蛋白浓度,配比取20μg蛋白上样,浓缩胶分离胶电泳,PVDF转膜,封闭。加入抗体xCT(1∶1200),GPX4(1∶1200),β-actin(1∶5000),二抗孵育,ECL显影保存条带,Image J软件定量条带灰度值,β-actin为内参对照。

3 统计分析

结 果

1 运动功能

BBB评分评估大鼠28d内的运动功能情况,Sham组评分正常, SCI组大鼠评分均低于Shan组(P<0.05),随着时间的延长,SCI大鼠的评分逐渐升高。 对比SCI组,Fasudil组第14、21 及28天时明显改善[(9.58 ± 2.19)分vs.(6.33 ± 2.35)分,t=4.33,P<0.05]、[(13.83 ± 4.47)分vs.(8.92 ± 2.47)分,t=5.90,P<0.05]、[(15.67 ± 4.36)分vs.(12.08 ± 2.65)分,t=2.98,P<0.05]。这表明SCI后大鼠运动功能逐渐恢复,而使用Fasudil治疗后BBB评分进一步升高,进一步促进了大鼠的运动功能的恢复。见图1。

图1 Fasudil增加大鼠的BBB评分,与Sham组比较,aP<0.05,bP<0.05,cP<0.05;与SCI组比较:aP<0.05,bP<0.05,cP<0.05

2 Fe2+含量

Sham组脊髓组织Fe2+含量较低为(84.2±11.2)%,对比Sham组,SCI组SCI部位组织Fe2+含量明显增多(176 .7±31.5)%(t=5.91,P<0.001)。对比SCI组, Fasudil组SCI部位组织Fe2+含量明显降低(127.8±33.1)%(t=3.11,P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠SCI部位组织Fe2+含量,与Sham组比较,aP<0.001;与SCI组比较:bP<0.05

3 ROS含量

Sham组脊髓组织ROS含量较低为(95.8±12.0)%,对比Sham组,SCI组SCI部位组织ROS含量明显增多(162.2±28.0)%(t=4.86,P<0.001)。对比SCI组, Fasudil组SCI部位组织ROS含量明显减少(123.8±27.6)%(t=2.83,P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠SCI部位组织ROS含量。与Sham组比较,aP<0.001;与SCI组比较:bP<0.05

4 免疫印迹法中 Rho/ROCK2、xCT及GPX4的变化

Sham组可见Rho/ROCK2少量表达(0.28±0.039),xCT及GPX4大量表达(0.92±0.092)、(0.84±0.21),对比Sham组,SCI组SCI部位组织可见Rho/ROCK2表达增多(0.85±0.13)(t=7.81,P<0.001),xCT及GPX4表达减少(0.39±0.041)及(0.36±0.049)(t=14.43,5.78,P<0.001)。对比SCI组, Fasudil组SCI部位组织可见Rho/ROCK2表达减少(0.65±0.17)(t=2.71,P<0.05),xCT及GPX4表达增多(0.64±0.033)及(0.55±0.11)(t=6.91,2.35,P<0.05)。见图4。

图4 a.大鼠SCI组织ROCK2、xCT及GPX4的表达;b.ROCK2/β-actin比值;c.xCT/β-actin比值;d.GPX4/β-actin比值。与Sham组比较:aP<0.001;与SCI组比较:bP<0.05

讨 论

各种创伤因素导致SCI后,损伤周围组织的内外环境受到影响[12],血供被破坏,细胞通透性增强,局部Fe2+含量的增高,铁超载进一步影响增加了ROS的堆积,抑制神经轴突再生[13]。相关体内研究也发现,在SCI模型中,早期的继发性SCI的组织内的Fe2+发挥着非常重要作用,与损伤程度呈正相关[14]。本研究中,SCI后脊髓组织的Fe2+及ROS水平明显升高,这与上述研究结果一致。而使用法舒地尔治疗后,大鼠脊髓组织内Fe2+及ROS水平降低,大鼠的BBB评分升高,表明法舒地尔在SCI后可以减轻脊髓受损并改善运动功能。Fe2+含量增多后诱发脂质过氧化,谷胱甘肽大量消耗,GPX4大量失活,抗氧化防御系统调控失衡,脂质醇生成增多,过氧化物蓄积及细胞损伤,诱发铁死亡[15]。应用铁死亡特异性抑制剂及铁螯合剂处理SCI大鼠,在损伤的脊髓组织中发现铁死亡相关蛋白的表达,降低炎症因子,促进组织修复,减少了活化的星形胶质细胞,明显改善大鼠肢体活动[6-7]。这些铁死亡的体外研究表明,修复SCI的机制可能是通过抑制铁死亡通路实现,此结论与本研究结论一致,通过法舒地尔进行干预后SCI大鼠脊髓组织中Fe2+含量减少,铁死亡负调控相关蛋白xCT及GPX4表达增多,铁死亡减少,大鼠SCI减轻,肢体运动功能改善。笔者推测法舒地尔的具体干预靶点对铁死亡有重要影响,因此对实验过程中的Rho/ROCK2激酶进行了检测。

Rho蛋白是小G蛋白家族的亚家族成员,参与SCI的炎症反应,对细胞外基质黏附、骨架重组有重要调控作用。SCI的体外实验[16]中Rho/ROCK2表达异常增高,与大鼠的预后有着密切关系。SCI后神经髓鞘分泌轴突抑制剂,与NgR形成复合物,激活下游级联反应,通过信号通路及其他旁路激活ROCK2通路,重组细胞骨架,导致轴突塌陷和神经突出生长抑制,抑制细胞间信号传导及细胞再生[17]。Zhao等[18]研究表明可能反应性星形细胞增生引起的神经胶质瘢痕可能是影响轴突再生的重要原因,通过基因修饰抑制NgR通路后可减少神经胶质瘢痕产生,明显改善SCI后轴突再生和功能,而NgR可以影响ROCK2通路。因此,RHO/ROCK2激酶是SCI影响的一个重要因素,而RHO/ROCK2激酶对铁死亡的报道甚少。以上结论与本研究结论相似,SCI后大鼠脊髓中的Fe2+含量增多,ROCK2表达增高,铁死亡增强,肢体运动功能损伤,而用ROCK2特异性抑制剂法舒地尔治疗后Fe2+含量减少,ROCK2表达明显降低,铁死亡减弱,大鼠肢体活动改善。RHO/ROCK2激酶的底物种类多,作用靶点多,有潜在的不良反应,后期需要进一步研究及防治。

综上,法舒地尔可能通过抑制RHO/ROCK2激酶,降低了铁死亡,改善了大鼠肢体功能,RHO/ROCK2激酶可能是治疗SCI的一条重要调节通路。

作者贡献声明：翟永喜:实验实施、论文撰写;孙林林:SCI模型制作、实验技术指导、统计分析及论文修改